Doc-1基因編碼蛋白p12某些結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測及相關(guān)人舌鱗癌(Tca-8113)細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建.pdf

1、癌癥是一類嚴(yán)重威脅人類健康、導(dǎo)致死亡的常見病、多發(fā)病，是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究的重要課題之一。而口腔癌的發(fā)生率排在世界癌發(fā)生率的第六位。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，從分子水平上研究腫瘤發(fā)生的機(jī)制及其與癌基因、抑癌基因的關(guān)系已成為腫瘤基因治療的主要方向之一。癌癥的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)?？谇话┤笔?1（deletedinoralcancer-1,DOC-1）基因是Todd等于1995年利用倉鼠口腔癌模型分離和證實(shí)

2、的一個候選抑癌基因，p12蛋白是其編碼的具有腫瘤生長抑制功能的蛋白。作為一種新的候選抑癌基因逐年受到醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注。人類DOC-1位于染色12q24，cDNA全長為1627bp，編碼115個氨基酸，具有4個外顯子，p12分子量為12.4kDa。DOC-1可以誘導(dǎo)倉鼠口腔惡性角化細(xì)胞的凋亡。p12蛋白通過兩種重要的細(xì)胞伴侶（細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶2和DNA聚合酶α）而對細(xì)胞周期中的S期進(jìn)行調(diào)控。p12蛋白是一種CDK2的相關(guān)蛋白，對激酶

3、的活性起負(fù)調(diào)控作用，并通過下調(diào)活性CDK2的表達(dá)水平，減弱對Rb基因活性的抑制，從而抑制腫瘤的生長，并且在鱗狀細(xì)胞癌中異位表達(dá)p12后可以轉(zhuǎn)變細(xì)胞系的惡性表型，部分是因?yàn)閜12與CDK2和DNA聚合酶α結(jié)合，從而抑制了他們的活性。p12蛋白在人口腔鱗癌中的表達(dá)顯著降低甚至缺失，但其缺失的機(jī)理和水平尚未見報道。
　　本研究采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫及相關(guān)軟件預(yù)測DOC-1基因編碼蛋白p12的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和可能存在的功能位點(diǎn)，構(gòu)建人舌

4、鱗癌（Tca-8113）細(xì)胞cDNA文庫，運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與p12蛋白相互作用的蛋白，從而發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致p12蛋白在口腔癌缺失中的相關(guān)因子，進(jìn)一步闡明DOC-1基因缺失的機(jī)理，為下一步研究DOC-1的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　本課題研究的目的是通過構(gòu)建人舌鱗癌(Tca-8113)細(xì)胞cDNA文庫，用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測p12蛋白的理化性質(zhì)和高級結(jié)構(gòu)以及可能與其相互作用的因子，為下一步運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出新的蛋白

5、，研究DOC-1基因及其蛋白在口腔癌發(fā)生中的作用與調(diào)控機(jī)制提供重要工具。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.使用生物信息學(xué)技術(shù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫和軟件預(yù)測DOC-1基因編碼的p12蛋白的某些結(jié)構(gòu)和功能基序，尋找可能與其相互作用的因子。查詢GenBank數(shù)據(jù)庫得到DOC-1基因的堿基序列和p12蛋白的氨基酸序列；通過http://www.expasy.org/tools/＃proteome得到p12的理化性質(zhì)；由TMHMM站點(diǎn)http://ww

6、w.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/了解該基因編碼的蛋白質(zhì)是否具有跨模結(jié)構(gòu)；由PSORT主頁的http://psort.nibb.ac.jp/預(yù)測其亞細(xì)胞定位。通過ExPASy的http://www.expasy.org/及Jpred的http://www.compbio.dundee.ac.uk/～www-jpred/得到p12可能的功能基序和功能位點(diǎn)以及二級結(jié)構(gòu)（α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲等）的預(yù)測和分析

7、。2.構(gòu)建人舌鱗癌（Tca-8113）細(xì)胞cDNA文庫。用Trizol法提取人舌鱗癌（Tca-8113）細(xì)胞的總RNA，使用OligotexmRNAMiniKit分離純化mRNA，使用LibraryConstructionKitandcDNASynthesisKit構(gòu)建人舌鱗癌（Tca-8113）細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　獲得了p12蛋白的外顯子和理化性質(zhì)信息，預(yù)測了可能存在的功能基序及二級結(jié)構(gòu)，人舌鱗癌（