DOC-1基因在口腔鱗癌中的表達差異及p12DOC-1外源性表達對Tca8113細胞的影響.pdf

1、口腔癌是口腔頜面部最常見的腫瘤，其發(fā)病部位位于體表或接近體表部位，故嚴重影響患者正常的生理功能及社會交往。隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，許多疾病的發(fā)生、發(fā)展都已經(jīng)從基因水平上得到相應的解釋。癌基因與抑癌基因的突變、失活、表達異常是癌癥發(fā)生的主要原因，近年來一些與口腔癌相關的基因被相繼發(fā)現(xiàn)，為從分子水平上研究口腔癌的發(fā)生、發(fā)展提供了可能?？谇话┤笔Щ?（deletedinoralcancer-1,DOC-1）是哈佛大學Todd于1995

2、年在倉鼠口腔上皮中發(fā)現(xiàn)的一個候選抑癌基因，p12蛋白是該基因編碼的蛋白產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)p12蛋白具有抑制腫瘤生長的功能。人類DOC-1位于染色體12q24，cDNA全長為1627bp,編碼115個氨基酸,蛋白產(chǎn)物分子量為12.4kDa。
　　目的
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同分化程度的口腔鱗癌中p12蛋白的表達量有差異，本課題研究的目的是通過半定量RT-PCR的方法，來觀察DOC-1基因在不同分化程度的口腔癌中mRNA的表達

3、含量是否有區(qū)別。構建DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達載體，轉染舌癌Tca8113細胞株，觀察外源性表達的p12蛋白對舌癌Tca8113細胞的生物學行為的影響。
　　方法
　　1.通過設計特異性引物，采用RT-PCR的方法檢測口腔鱗狀細胞癌和正?？谇徽衬そM織中DOC-1基因mRNA的表達。所得產(chǎn)物電泳后經(jīng)計算機凝膠成像系統(tǒng)測定每個產(chǎn)物的灰度值，通過與內參照的灰度值進行對比得到每個產(chǎn)物的一個相對值，再對得到的相對值進行統(tǒng)計學

4、分析。2.設計針對人DOC-1基因ORF編碼區(qū)的引物，從HaCaT(人永生化表皮細胞)中克隆出ORF編碼區(qū)序列，在序列兩端連入相應的特異性酶切位點，經(jīng)酶切、連接、轉化、測序，成功構建含有DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達載體。3.將構建好的含有DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達載體通過轉染試劑盒轉染舌癌Tca8113細胞株，穩(wěn)定轉染后測定轉染前后細胞增殖能力和細胞侵襲能力，觀察外源性表達的p12蛋白對舌癌Tca8113細胞的生物學行

5、為的影響。
　　結果
　　1.DOC-1基因mRNA在口腔癌中的灰度值為1.22±0.12，在口腔粘膜中的灰度值為1.58±0.15；DOC-1mRNA在高分化口腔癌中的灰度值為1.35±0.04，在中分化口腔癌中的灰度值為1.20±0.05，在低分化口腔癌中的灰度值為1.08±0.03。2.構建好的載體經(jīng)雙酶切、電泳、測序鑒定，表明含有DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達載體pEGFP-N1-DOC-1構建成功。3.篩選出

6、的穩(wěn)定轉染細胞與對照組細胞比較，細胞增殖能力降低，細胞侵襲轉移能力也降低，且與對照組細胞相比，改變具有顯著性。
　　結論
　　本實驗證實了DOC-1基因mRNA的表達量在不同分化程度的口腔鱗癌中有差異，口腔鱗癌分化程度越低，DOC-1基因mRNA的表達量也越低。DOC-1基因可能在口腔鱗狀細胞癌早期具有重要作用，DOC-1基因mRNA的低表達可能是口腔鱗狀細胞癌中的早期事件。成功構建了含有DOC-1基因ORF編碼區(qū)的真核表達