hTERT反義基因在舌鱗癌Tca8113細胞中表達的研究.pdf

1、大連醫(yī)科大學碩士學位論文hTERT反義基因在舌鱗癌Tca8113細胞中表達的研究姓名：張麗娟申請學位級別：碩士專業(yè)：皮膚病及性病學指導教師：劉曉明2002.5.1空載體pLNCX轉染的陽性克隆命名為pLNCXhTERTy作為對照。提取基因組DNA，用根據逆轉錄病毒載體pLNCX序列設計的引物P3、P4進行PCR擴增，產物經15％瓊脂糖凝膠電泳檢測：同時將提取的基因組DNA用EeoRI和BamHI雙酶切，切下的DNA片段以Neo’基因片段

2、作為探針進行雜交，檢測外源基因的整合。穩(wěn)定轉染的細胞以DNA測序法分析端粒酶活性并制作細胞生長曲線觀察細胞的生長增殖情況。(結果：(1)提取Hela細胞的RNA，經逆轉錄得到cDNA后，以引玢Pl、P2進行PCR擴增得到的hTERT基因片段長度為170bp。(2)構建的hTERT基因反義表達質粒經PCR初步篩選鑒定后，進一步提取該質粒DNA進行酶切鑒定，電泳可見162bp的基因片段。酶切結果正確的質粒，再進行序列測定，結果表明，hTER

3、T基因片段正確地反向插入到逆轉錄病毒載體上。(3)PCR和Southern雜交分析外源基因在基因組DNA中的整合：未轉染的細胞基因組DNA沒有載體的引物序列，因此用P3、P4進行PCR無擴增帶。pLNCXhTERT。細胞能擴增出不包含hTERT反義基因的載體片段，長度為176bp。pLNCXhTERT細胞可擴增出含有載體序列及hTERT基因的DNA片段，長度為332bp。以NeoR基因片段為探針對酶切的基因組DNA進行Southern雜

4、交，轉染細胞檢測到分子量在1180bp左右的雜交帶，而未轉染的細胞沒有雜交帶。說明外源hTERT基因已整合到Tca8113細胞基因組中(4)DNA測序儀檢測分析端粒酶活性，可見相差6個堿基的綠色峰和紅色內標DNA片段的峰。以每個峰的峰面積總和作為端粒酶活性的強度結果表明轉染后Tca8113細胞的端粒酶活性較轉染前明顯降低。(5)繪制生長曲線發(fā)現(xiàn)，轉染細胞的生長速度一，明顯低于對照細胞，倍增時間也明顯延長。1f結論：(1)本研究利用體外基