玉米大斑病菌MAPK級聯(lián)途徑中StSTE12基因的克隆與功能分析.pdf

1、為了明確玉米大斑病菌Fus3/Kss1-homolog途徑在病菌生長發(fā)育及致病過程中的調(diào)控作用,本研究通過候選基因法和Genome-walking技術(shù)克隆得到了玉米大斑病菌MAPK級聯(lián)途徑Fus3/Kss1通路下游的一個基因StSTE12;利用生物信息學(xué)方法對該基因進行保守結(jié)構(gòu)域和進化樹分析,發(fā)現(xiàn)它與其它植物病原真菌的Ste12-like蛋白聚為同一類,具有這類轉(zhuǎn)錄因子特有的保守結(jié)構(gòu)域;利用β-半乳糖苷酶法檢測發(fā)現(xiàn),StSte12具有轉(zhuǎn)

2、錄自激活活性;通過酵母雙雜交技術(shù)初步證明StSte12受StStk2的調(diào)控;通過酵母異源互補和RNA干擾(RNAinterference,RaNAi)兩種方法分別創(chuàng)制酵母異源互補轉(zhuǎn)化子和RNAi沉默轉(zhuǎn)化子,并通過對酵母功能互補轉(zhuǎn)化子和RNAi轉(zhuǎn)化子進行分析,明確了該基因主要參與了病菌的附著胞發(fā)育及侵染過程,本試驗的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用候選基因法及Genome-walking技術(shù)得到了玉米大斑病菌StSTK2基因下游

3、的轉(zhuǎn)錄因子StSTE12,該基因DNA全長為2816bp,cDNA為2085bp,編碼694個氨基酸,包含5個外顯子和4個內(nèi)含子;通過蛋白比對發(fā)現(xiàn),StSte12具有轉(zhuǎn)錄因子特有的STEhomeodomain和ZnFCzH2鋅指結(jié)構(gòu);同源性分析顯示,該基因與其它植物病原真菌的STE12-like基因有較高的同源性。
　　 2.利用β-半乳糖苷酶法檢測發(fā)現(xiàn),StSte12能夠激活下游基因LACZ的表達,經(jīng)X-α-Gal染色后顯示藍

4、色,說明StSte12具有轉(zhuǎn)錄自激活活性;通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn),StSte12受StStk2的調(diào)控,對于它們之間究竟如何作用還需進一步的研究。
　　 3.將StSTE12基因轉(zhuǎn)化至釀酒酵母ScSTE12基因的缺失突變體中,篩選釀酒酵母ScSTE12基因的功能互補突變體并對其進行分析,發(fā)現(xiàn)StSTE12基因可以回復(fù)釀酒酵母ScSTE12基因的功能,能夠調(diào)控酵母細胞的侵入生長。
　　 4.以pSilent-1質(zhì)粒作為載體,

5、構(gòu)建StSTE12基因的RNA干擾載體,將該載體通過PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌原生質(zhì)體,通過潮霉素B篩選、PCR檢測以及RT-PCR的驗證得到了3株StSTE12基因的RNAi轉(zhuǎn)化子。
　　 5.對StSTE12基因的RNAi轉(zhuǎn)化子進行分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的致病力均降低,且不能夠直接侵染健康的玉米植株,只能通過傷口侵入,但是轉(zhuǎn)化子的毒素活性并不減弱。此外,與野生型菌株相比,轉(zhuǎn)化子的分生孢子產(chǎn)量、黑色素的生物合成明顯減少,附