結(jié)締組織生長因子在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及其與周期蛋白D1的關(guān)系.pdf

1、第一部分結(jié)締組織生長因子和周期蛋白D1在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)中的表達變化
　　 目的：探討煙霧暴露致大鼠肺血管重構(gòu)中結(jié)締組織生長因子(CTGF)和周期蛋白D1（cyclinD1）的表達變化及意義。
　　 方法：健康雄性SD大鼠24只，隨機分為對照組，煙霧暴露2周、煙霧4周和煙霧暴露8周組，取動脈血檢測血氧分壓(PaO2)，HE染色和平滑肌細胞α肌動蛋白(α-SM-actin)染色觀察肺血管重構(gòu)，免疫組化觀察CTGF

2、和cyclinD1在肺動脈平滑肌中的表達，實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測肺動脈CTGFmRNA和cyclinD1mRNA表達，Western Blotting檢測CTGF和cyclinD1蛋白表達。
　　 結(jié)果：各組大鼠動脈血氧分壓均無顯著性差異。隨煙霧暴露時間延長，肌化血管比例、肺血管壁厚度和血管直徑比值（％WT）、CTGF和cyclinD1的mRNA和蛋白表達均呈時間依賴性增加，各組間比較均有顯著差異。C

3、TGF與 cyclinD1表達與肺血管壁厚度和血管直徑比值（％WT）顯著正相關(guān)，二者的表達之間也呈顯著正相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論：煙霧暴露大鼠中，CTGF和cyclinD1表達均隨暴露時間（2w~8w）延長而顯著上調(diào)，二者可能與煙霧暴露致肺動脈平滑肌細胞異常增殖有關(guān)。
　　 第二部分結(jié)締組織生長因子在香煙煙霧提取物導(dǎo)致的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用及其和周期蛋白D1的關(guān)系
　　 目的：香煙煙霧可以誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)

4、的發(fā)生，肺血管重構(gòu)的特點是肺動脈平滑肌細胞的異常增殖導(dǎo)致的肺動脈中膜增厚。但是，該病理過程的具體機制不明。本研究的目的是探討結(jié)締組織生長因子是否通過上調(diào)肺動脈平滑肌細胞的周期蛋白D1的表達進而調(diào)節(jié)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖。
　　 方法：原代培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞，使用不同的CSE濃度（1％，2％，5％，10％）進行孵育，24小時后使用細胞計數(shù)方法檢測不同CSE濃度對細胞增殖的影響。根據(jù)結(jié)果，2％CSE對細

5、胞的增殖促進作用最強。將細胞分為5組，正常對照組，2％CSE組，2％CSE+CTGFsiRNA組，2％CSE+NCsiRNA組，2％CSE+cyclinD1siRNA組，各組同步化后轉(zhuǎn)染相關(guān)的siRNA，再給予2％CSE孵育。使用細胞計數(shù)法和 BrdU檢測評價細胞增殖情況。定量PCR檢測結(jié)締組織生長因子和周期蛋白D1的mRNA表達水平，western blotting和免疫熒光染色檢測結(jié)締組織生長因子和周期蛋白D1的蛋白表的水平。流式細

6、胞術(shù)檢測細胞周期的分布。
　　 結(jié)果：在2％CSE的刺激下，大鼠肺動脈平滑肌細胞的結(jié)締組織生長因子mRNA水平和蛋白水平均升高，并促進細胞增殖。CTGFsiRNA抑制CSE誘導(dǎo)的細胞增殖。此外，CTGFsiRNA明顯抑制cyclinD1的mRNA水平和蛋白水平，并導(dǎo)致細胞周期G1期停滯，進而減少大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖。
　　 結(jié)論：上述結(jié)果表明，結(jié)締組織生長因子促進香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖，部分原

7、因是其上調(diào)周期蛋白D1的表達。
　　 第三部分結(jié)締組織生長因子在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及其和周期蛋白D1的關(guān)系
　　 目的：香煙煙霧通過誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)導(dǎo)致肺動脈高壓，肺血管重構(gòu)涉及肺動脈平滑肌細胞增殖。結(jié)締組織生長因子是一種富含半胱氨酸的肽，參與多重生物過程，入細胞增殖，細胞遷移。本研究目的是探討結(jié)締組織生長因子在肺血管重構(gòu)中的潛在作用。
　　 方法：構(gòu)建表達shRNA的干擾質(zhì)粒，降低原代培養(yǎng)的大鼠肺

8、動脈平滑肌細胞和大鼠肺動脈中的結(jié)締組織生長因子表達。將大鼠肺動脈平滑肌細胞使用香煙煙霧提取物孵育，大鼠分為4組，正常對照組，煙霧暴露組，煙霧暴露加CTGFshRNA干預(yù)組，煙霧暴露加陰性對照shRNA干預(yù)組，每組6只。煙霧暴露時間為3個月。通過尾靜脈注射給予質(zhì)粒。
　　 結(jié)果：CTGFshRNA抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺動脈平滑肌細胞中的結(jié)締組織生長因子和周期蛋白D1表達，導(dǎo)致細胞周期G1期停滯，抑制細胞增殖。尾靜脈注射CTGF干