結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在煙霧致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)積聚中的作用.pdf

1、第一部分
　　 目的：探討在煙霧暴露致大鼠肺血管重塑中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的變化及意義。
　　 方法：24只雄性成年Wistar大鼠隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組、煙霧暴露1月組、煙霧暴露2月組和煙霧暴露3月組，HE染色觀察肺血管重塑，天狼猩紅染色檢測(cè)肺動(dòng)脈壁膠原增殖，免疫組織化學(xué)染色法觀察增殖細(xì)胞核抗原在肺動(dòng)脈中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)四組肺動(dòng)脈管壁面積/管總面積別為(30.5±1.6)[％]、(43.3±2.0

2、)[％]、(49.3±1.2)[％]、(60.3±2.9)[％]，隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，WA[％]逐漸增加。(2)四組肺動(dòng)脈管壁膠原厚度分別為(4.5±0.7)μm、(8.8±1.2)μm、(11.8±2.7)μm、(15.3±2.9)μm。隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，肺動(dòng)脈管壁膠原異常增多、沉積逐漸加重，且以Ⅰ型膠原為主。(3)四組肺動(dòng)脈PCNA表達(dá)量分別為(0.082±0.022)、(0.147±0.032)、(0.286±0.022)、(0

3、.297±0.041)。隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，肺動(dòng)脈PCNA表達(dá)量逐漸增加。(4)四組肺動(dòng)脈CTGF Mrna相對(duì)表達(dá)量分別為(0.032±0.012)、(0.644±0.351)、(2.749±0.458)、(2.337±0.149)。隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，肺動(dòng)脈CTGF Mrna表達(dá)量逐漸增加。(5)四組肺動(dòng)脈CTGF蛋白表達(dá)量分別為(0.218±0.037)、(0.754±0.142)、(1.439±0.348)、(2.267±0.5

4、19)。隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，肺動(dòng)脈CTGF蛋白表達(dá)量逐漸增加。(6)肺動(dòng)脈CTGF Mrna及蛋白表達(dá)量與WA[％]均呈正相關(guān)，CTGF Mrna及蛋白表達(dá)量與PCNA表達(dá)亦均呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：大鼠煙霧暴露后早期即出現(xiàn)肺血管重塑，且隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，CTGF在肺動(dòng)脈中的表達(dá)逐漸升高，可能在此過(guò)程中起重要作用。
　　 第二部分
　　 目的：探討對(duì)煙霧暴露大鼠在體應(yīng)用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子反義寡核苷酸對(duì)肺血管重塑的

5、影響。
　　 方法：35只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、煙霧暴露1月組、煙霧暴露+大劑量CTGF ASON1月組、煙霧暴露+小劑量CTGF ASON1月組、煙霧暴露2月組、煙霧暴露+大劑量CTGF ASON2月組、煙霧暴露+小劑量CTGF ASON2月組，每組5只。HE染色觀察肺血管重塑，免疫組化觀察增殖細(xì)胞核抗原及CTGF在肺動(dòng)脈中的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)肺動(dòng)脈CTGF Mrna表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)各組肺動(dòng)脈管壁面積/

6、管總面積分別為(28.6±1.2)[％]、(42.5±2.3)[％]、(33.7±1.8)[％]、(42.1±2.4)[％]、(49.6±2.1)[％]、(34.3±1.9)[％]、(38.4±2.0)[％]。C組較B組顯著降低，F(xiàn)、G組較E組顯著降低。(2)各組肺動(dòng)脈平滑肌PCNA表達(dá)分別為(0.102±0.026)、(0.186±0.033)、(0.146±0.022)、(0.179±0.032)、(0.348±0.041)、(0.

7、149±0.030)、(0.156±0.034)。C組較B組顯著降低，F(xiàn)、G組較E組顯著降低。(3)各組肺動(dòng)脈平滑肌CTGF蛋白表達(dá)(A值)分別為(0.098±0.015)、(0.159±0.023)、(0.118±0.017)、(0.153±0.022)、(0.406±0.036)、(0.109±0.012)、(0.146±0.024)。C組較B組顯著降低，F(xiàn)、G組較E組顯著降低。(4)各組肺動(dòng)脈CTGF Mrna表達(dá)(A值比)分別為

8、(0.051±0.010)、(0.823±0.096)、(0.216±0.056)、(0.810±0.085)、(2.452±0.267)、(0.207±0.062)、(0.509±0.067)。C組較B組顯著降低，F(xiàn)、G組較E組顯著降低。(5)肺動(dòng)脈CTGF Mrna及蛋白表達(dá)量與WA[％]均呈正相關(guān)，CTGF Mrna及蛋白表達(dá)量與PCNA表達(dá)亦均呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：在體應(yīng)用CTGFASON可顯著降低煙霧暴露誘導(dǎo)的大鼠肺

9、血管重塑，CTGF可能在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　 第三部分
　　 目的：探討香煙提取物對(duì)培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在其中的作用。
　　 方法：培養(yǎng)的Rpasmc隨機(jī)分為組：正常對(duì)照組、CSE組、缺氧對(duì)照組、CSE+rhTGF-β1組、CSE+CTGF正義寡核苷酸組、CSE+CTGF反義寡核苷酸組，干預(yù)24h后用MTT比色法及增殖細(xì)胞核抗原免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)增殖變化，用逆

10、轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CTGF Mrna及蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中型膠原含量。
　　 結(jié)果：B組MTT結(jié)果為(0.311±0.009)，與A組(0.230±0.010)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D組(0.351±0.014)、F組(0.268±0.007)與B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而E組(0.303±0.011)與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PCNA染色變化與MTT結(jié)果有相似趨勢(shì)。Rpasmc

11、內(nèi)CTGF蛋白表達(dá)量B組為(0.314±0.005)，與A組(0.199±0.005)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D組(0.392±0.008)、F組(0.202±0.009)與B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而E組(0.323±0.007)與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CTGF Mrna表達(dá)結(jié)果與蛋白表達(dá)有相似趨勢(shì)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中?型膠原含量B組為(78.7±1.3)ng/ml，與A組[(50.9±1.0)ng/ml]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D組

12、[(104.9±2.0)ng/ml]、F組[(51.4±0.6)ng/ml]與B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而E組[(81.7±1.8)ng/ml]與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：CSE能誘導(dǎo)Rpasmc細(xì)胞增殖，使細(xì)胞表現(xiàn)為合成表型，CTGF可能在其中起著重要作用。
　　 第四部分
　　 目的：探討在吸煙者及慢性阻塞性肺疾病患者的肺血管重塑中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的變化及意義。
　　 方法：24例

13、手術(shù)切除肺葉患者，分別為非吸煙對(duì)照組、吸煙組及吸煙伴COPD組各8例，HE染色觀察肺血管重塑，天狼猩紅染色及偏振光顯微鏡檢測(cè)膠原增殖，免疫組織化學(xué)染色觀察增殖細(xì)胞核抗原在肺動(dòng)脈的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)肺動(dòng)脈CTGF Mrna表達(dá)，Western Blot法觀察CTGF蛋白在肺動(dòng)脈中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)N組、S組和S+C組肺動(dòng)脈管壁面積/管總面積分別為(28.4±4.7)[％]、(46.3±3.5)[％]、(55.

14、5±3.9)[％]，S組及S+C組較N組管壁明顯增厚。(2)N組、S組和S+C組肺動(dòng)脈壁膠原厚度分別為(6.4±1.6)μm、(15.9±2.4)μm、(16.4±2.3)μm，S組及S+C組膠原較N組明顯增多。(3)N組、S組和S+C組肺動(dòng)脈PCNA表達(dá)量分別為(0.084±0.006)、(0.178±0.018)、(0.226±0.134)，S組及S+C組表達(dá)較N組明顯增加。(4)N組、S組和S+C組肺動(dòng)脈CTGF Mrna表達(dá)量分

15、別為(0.095±0.015)、(0.396±0.167)、(0.501±0.177)，S組及S+C組表達(dá)較N組明顯增加。(5)N組、S組和S+C組肺動(dòng)脈CTGF蛋白表達(dá)量分別為(0.158±0.021)、(0.545±0.095)、(1.303±0.191)，S組及S+C組表達(dá)較N組明顯增加。(6)CTGF Mrna及蛋白表達(dá)量與WA[％]均呈明顯正相關(guān)，CTGF Mrna及蛋白表達(dá)量與PCNA亦均呈明顯正相關(guān)。
　　 結(jié)論：

16、單純吸煙者即已有肺血管重塑，伴有COPD者更加加重，CTGF可能在此過(guò)程中起重要作用。
　　 第五部分
　　 目的：探討香煙提取物對(duì)培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在其中的作用。
　　 方法：培養(yǎng)的Hpasmc隨機(jī)分為7組：正常對(duì)照組、缺氧對(duì)照組、CSE組、CSE+rhTGF-β1組、CSE+CTGF正義寡核苷酸組、CSE+CTGF反義寡核苷酸組，干預(yù)24h后用MTT比色法及增殖細(xì)胞核抗原免疫

17、細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)增殖變化，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CTGF Mrna及蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中型膠原含量。
　　 結(jié)果：C組的MTT結(jié)果為(0.275±0.007)，與A組(0.212±0.007)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組(0.322±0.009)、F組(0.245±0.005)與C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E組(0.283±0.010)與C組之間無(wú)顯著性差異；PCNA染色變化與MTT結(jié)果

18、有相似趨勢(shì)。Hpasmc內(nèi)CTGF蛋白表達(dá)量C組為(0.368±0.006)，與A組(0.208±0.003)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而D組(0.432±0.008)、F組(0.218±0.004)與C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；E組(0.380±0.009)與C組之間無(wú)顯著性差異；CTGF Mrna表達(dá)結(jié)果與蛋白表達(dá)有相似趨勢(shì)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中型膠原含量C組為(215.4±3.9)ng/ml，與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D組[(257.5