C2C12GLUT4myc骨骼肌細(xì)胞株的建立及肌肉收縮調(diào)節(jié)GLUT4轉(zhuǎn)位的機(jī)制研究.pdf

1、胰島素和運(yùn)動均促使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，轉(zhuǎn)運(yùn)更多的葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞而調(diào)節(jié)細(xì)胞的葡萄糖攝取量。相對于胰島素，對運(yùn)動/肌肉收縮刺激骨骼肌攝取葡萄糖的機(jī)制了解較少。
　　 目前研究運(yùn)動/肌肉收縮多應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物，費(fèi)用昂貴，而且不能應(yīng)用基因沉默等技術(shù)。而培養(yǎng)的細(xì)胞株則沒有諸多限制，可單獨(dú)分析細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，排除血液循環(huán)成分和血液動力學(xué)因素的影響，更好地理解鍛煉如何改善胰島素作用。目前廣泛應(yīng)用的L6骨骼肌細(xì)胞不具收縮能力。具收縮能力

2、的C2C12骨骼肌細(xì)胞僅表達(dá)少量的GLUT4，使得運(yùn)動調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，因缺少合適的肌肉模型而受到限制。本研究的目的是建立C2C12GLUT4myc細(xì)胞株，并應(yīng)用此細(xì)胞模型探討運(yùn)動/肌肉收縮刺激骨骼肌細(xì)胞GLUT4運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制。
　　 內(nèi)容和方法：
　　 第一部分建立C2C12GLUT4myc細(xì)胞株；檢測分化能力和GLUT4myc的表達(dá)量，確定分化能力強(qiáng)并高表達(dá)GLUT4myc的細(xì)胞株。與L6GLUT4myc比較膜蛋白

3、和信號分子以及GLUT1的表達(dá)；免疫熒光檢測GLUT4myc在細(xì)胞中的定位；測定此細(xì)胞響應(yīng)胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位的時(shí)間曲線和劑量曲線。
　　 第二部分比較carbachol、AICAR和胰島素刺激的C2C12GLUT4myc肌管葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位，并觀察三種刺激物作用的疊加性。通過使用各種信號蛋白的抑制劑，分析刺激GLUT4轉(zhuǎn)位的信號機(jī)制。
　　 第三部分比較三種刺激物對信號分子的作用，檢測信號分子的活性。<

4、br>　　 結(jié)果：
　　 建立了C2C12GLUT4myc細(xì)胞株，GLUT4myc的表達(dá)量與L6GLUT4myc中的GLUT4myc量接近，約為小鼠骨骼肌GLUT4的10倍。C2C12GLUT4myc細(xì)胞表達(dá)IRAP和TfR的量高于L6GLUT4myc，VAMP2和VAMP7的表達(dá)在兩種細(xì)胞中接近。C2C12GLUT4myc細(xì)胞表達(dá)AS160、AMPKα2和GLUT1高于L6GLUT4myc細(xì)胞，而Akt1和Akt2的表達(dá)則低

5、于L6GLUT4myc。兩種細(xì)胞表達(dá)AMPKα1、Akt3和PKC的量相近。GLUT4myc主要分布于細(xì)胞核周圍。C2C12GLUT4myc細(xì)胞的葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位對胰島素的作用呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，最大值為基礎(chǔ)狀態(tài)的1.63±0.05倍。
　　 比較carbachol、AICAR和胰島素刺激的C2C12GLUT4myc肌管葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位，并觀察三種刺激物作用的疊加性的結(jié)果顯示，carbachol刺激葡萄糖攝

6、取和增加細(xì)胞表面GLUT4myc含量，使之分別增加為基礎(chǔ)組的1.604±0.08倍和1.774±0.08倍。胰島素使葡萄糖攝取和細(xì)胞膜上GLUT4myc分別增加1.55±0.02倍和1.63±0.05倍。AICAR使葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位分別增加1.63±0.11倍和1.84±0.11倍。三種刺激物的作用均具有疊加性。胰島素和carbachol一起孵育使GLUT4myc細(xì)胞轉(zhuǎn)位增加2.57±0.30倍。胰島素和AICAR一起孵育使G

7、LUT4myc轉(zhuǎn)位增加2.80±0.30倍。Carbachol和AICAR一起孵育使GLUT4myc轉(zhuǎn)位增加2.95±0.38倍。LY294002不能抑制carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位，但此作用可被Compound C抑制85％。BTS可抑制57％的carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位。Compound C抑制84％AICAR刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位，但不影響基礎(chǔ)和胰島素作用下的細(xì)胞膜上的GLUT4myc水平。B

8、IM和KN93均抑制carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位。
　　 比較三種刺激物對信號分子的作用的結(jié)果顯示，carbachol和AICAR激活A(yù)MPK：Compound C抑制carbachol和AICAR刺激的AMPK磷酸化。carbachol不能誘導(dǎo)Akt的磷酸化，但增加Rab-GAP，AS160 Thr642的磷酸化。
　　 結(jié)論：
　　 1.可收縮的C2C12GLUT4myc骨骼肌細(xì)胞的GLUT4

9、myc轉(zhuǎn)位對胰島素作用呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系；細(xì)胞響應(yīng)carbachol刺激的收縮作用，GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜并攝取葡萄糖。
　　 2.L6GLUT4myc和C2C12GLUT4myc骨骼肌細(xì)胞分別高表達(dá)胰島素關(guān)鍵信號分子Akt2和運(yùn)動關(guān)鍵信號分子AMPKα2，提示此兩種細(xì)胞株可分別用于研究胰島素作用和運(yùn)動/肌肉收縮作用的細(xì)胞模型。
　　 3.Carbachol去極化誘發(fā)的收縮刺激骨骼肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取，其信

10、號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制不同于胰島素和AICAR，參與的信號分子可能涉及LKB1、AMPK、CaMKⅡ和PKC。肌肉收縮可替代胰島素促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖。
　　 4.胰島素、AICAR和carbachol三種刺激物的信號途徑匯聚在AS160。
　　 本課題建立了可用于研究肌肉收縮刺激骨骼肌攝取葡萄糖機(jī)制的細(xì)胞模型，可用于篩查抗糖尿病藥物。并探討了收縮刺激GLUT4轉(zhuǎn)位的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，可為藥物研發(fā)提供作用靶點(diǎn)，并有助于臨床干預(yù)、改善胰島