SM22α調(diào)節(jié)GLUT4轉(zhuǎn)位的機制及其在血管平滑肌細胞增殖中的意義.pdf

1、目的：糖尿病患者血管成型術后再狹窄和動脈粥樣硬化的發(fā)生率明顯高于正常人。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）增殖需要消耗高水平的葡萄糖，增強的葡萄糖轉(zhuǎn)運、分解代謝和線粒體生物氧化是增殖的細胞能量轉(zhuǎn)換的重要特征。
　　葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT4)介導的葡萄糖攝取是血管平滑肌細胞糖攝取的主要機制，GLUT4在損傷誘導的新生內(nèi)膜中表達明顯增加。PDGF可通過激活PI3K促進GLUT4轉(zhuǎn)位進

2、而促進葡萄糖攝取，而PI3K激活介導的皮層肌動蛋白（actin）重構是GLUT4轉(zhuǎn)位所必須的。
　　平滑肌（smooth muscle，SM)22α,是一種actin細胞骨架相關蛋白，其主要功能是與actin結合，參與血管平滑肌細胞微絲聚合和骨架重構。在血管平滑肌細胞增殖相關的疾病如動脈粥樣硬化斑塊、腹主動脈瘤以及腫瘤組織中表達下調(diào)。我們先前實驗證明，高表達 SM22α可通過阻斷PDGF-BB刺激所激活的 Ras-ERK1/2信號

3、通路，進而抑制血管平滑肌細胞增殖,并且，敲低SM22α可引起類似PDGF-BB刺激所產(chǎn)生的actin細胞骨架的重構。但是，SM22α是否參與PDGF-BB誘導的GLUT4轉(zhuǎn)位尚不清楚。本研究旨在探討SM22α在PDGF-BB誘導的GLUT4轉(zhuǎn)位中的作用及其與細胞增殖活性的關系，揭示其作用的分子機制。
　　方法：
　　利用免疫熒光、Western blot技術檢測PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞GLUT4轉(zhuǎn)位及與細胞骨架重構

4、的關系；利用熒光葡萄糖2-NBDG檢測血管平滑肌細胞及動脈葡萄糖攝?。煌ㄟ^敲低SM22α，確定SM22α參與PDGF-BB誘導的GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝??；通過細胞計數(shù)和BrdU實驗檢測 GLUT4介導的葡萄糖攝取與血管平滑肌細胞增殖的相關性；利用Sm22α-/-小鼠建立頸總動脈損傷模型，用高效液相色譜法檢測組織葡萄糖含量，結合膜蛋白提取和Western blot技術，探討缺失SM22α在GLUT4轉(zhuǎn)位介導的葡萄糖攝取與損傷誘導的新生內(nèi)

5、膜形成之間的關系。用免疫熒光技術檢測平滑肌細胞微管的聚合情況；通過敲低或敲除或用腺病毒過表達SM22α，觀察SM22α與微管穩(wěn)定性的關系；利用Western blot技術檢測α-Tubulin乙?；剑挥肑C-1法檢測線粒體膜電位。
　　結果：
　　1 SM22α通過調(diào)節(jié)微絲骨架重構參與PDGF-BB誘導的GLUT4轉(zhuǎn)位和糖攝取
　　1.1 PDGF-BB誘導血管平滑肌細胞GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取
　　PDG

6、F-BB刺激血管平滑肌細胞0、5、10、15、20、30 min，提取膜蛋白，Western blot方法檢測膜上GLUT4的表達量。結果顯示，PDGF-BB刺激可誘導GLUT4向膜上轉(zhuǎn)位，膜組分中GLUT4含量于15 min達到峰值，隨后下降。熒光葡萄糖2-NBDG攝取實驗顯示，用PDGF-BB處理的細胞其2-NBDG的攝取也在15 min達到峰值，變化趨勢與GLUT4膜轉(zhuǎn)位一致，提示細胞對葡萄糖的攝取增加。
　　1.2肌動蛋白

7、重構調(diào)節(jié)PDGF-BB誘導的GLUT4轉(zhuǎn)位
　　細胞免疫熒光技術檢測細胞膜上GLUT4的表達和細胞骨架的變化。結果顯示，PDGF-BB刺激15 min,隨著細胞骨架重構，皮層F-actin聚合增加，GLUT4從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞邊緣，與細胞皮層聚合的F-actin發(fā)生共定位。而用細胞骨架穩(wěn)定劑 JPK預處理細胞后，PDGF-BB誘導的細胞骨架解聚和皮層F-actin聚合受抑制，同時GLUT4膜轉(zhuǎn)位明顯減少。2-NBDG攝取分析也顯示用

8、JPK預處理后，PDGF-BB刺激引起的血管平滑肌細胞葡萄糖攝取被抑制。以上結果表明，PDGF-BB誘導的 GLUT4膜轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取依賴于細胞骨架重構。
　　1.3 SM22α抑制GLUT4膜轉(zhuǎn)位
　　用SM22α特異性小干擾RNA（siSM22α）敲低血管平滑肌細胞內(nèi)源性SM22α，鬼筆環(huán)肽熒光染色觀察PDGF-BB刺激前后細胞骨架的變化。結果顯示，相對于siCon組，敲低SM22α后，血管平滑肌細胞基礎狀態(tài)下應力纖維

9、密度明顯減少，而PDGF-BB刺激引起的皮層F-actin聚合則更加明顯。同時，細胞免疫熒光結果顯示，敲低SM22α后PDGF-BB誘導的GLUT4轉(zhuǎn)位也明顯增加。Western blot方法檢測膜蛋白提取物中GLUT4的含量也得到相似結果。進一步用Sm22α-/-小鼠的細胞進行驗證，與野生型（WT）相比較，PDGF-BB誘導的Sm22α-/-小鼠的細胞皮層F-actin聚合和GLUT4轉(zhuǎn)位均明顯增加。以上結果證實了我們的假設，下調(diào)SM

10、22α通過增強actin動力學和皮層F-actin聚合從而促進PDGF-BB誘導的GLUT4轉(zhuǎn)位。
　　1.4下調(diào)SM22α表達可促進PDGF-BB誘導的葡萄糖攝取和代謝利用
　　分別檢測敲低SM22α的大鼠VSMC及Sm22α-/-小鼠細胞PDGF-BB誘導的熒光葡萄糖2-NBDG的攝取情況。結果顯示，敲低或敲除SM22α可促進PDGF-BB誘導的2-NBDG攝取，與相同條件下GLUT4轉(zhuǎn)位增強相一致。而用GLUT4活性抑

11、制劑Indinavir預孵育后，PDGF-BB誘導的2-NBDG攝取增加受到抑制，說明GLUT4是糖攝取的主要載體。相對于siCon組，用小干擾RNA敲低SM22α表達，可增強PDGF-BB誘導的己糖激酶和乳酸脫氫酶活性。以上結果表明，PDGF-BB可加速細胞糖代謝，SM22α缺失能夠促進這一過程。
　　2敲除SM22α通過加速葡萄糖攝取而促進血管平滑肌細胞增殖
　　2.1 GLUT4及其介導的葡萄糖攝取參與PDGF-BB誘

12、導的細胞增殖
　　用C57BL/6J野生型小鼠復制左側頸總動脈結扎模型。HE染色結果顯示，與假手術組相比，結扎的血管新生內(nèi)膜明顯增厚；組織免疫熒光染色結果也表明，新生內(nèi)膜處GLUT4表達顯著增加。體外研究顯示，PDGF-BB誘導的GLUT4表達，呈時間依賴性；同時伴隨細胞核增殖性抗原PCNA表達的增加。在相同刺激條件下，細胞培養(yǎng)基（低糖DMEM）中葡萄糖消耗也明顯增加。細胞計數(shù)和BrdU分析結果顯示，抑制GLUT4活性的細胞其增殖

13、活性顯著降低。以上結果表明，在PDGF-BB刺激下，GLUT4表達及其介導的葡萄糖攝取參與了細胞增殖。
　　2.2 Sm22α-/-小鼠主動脈GLUT4介導的2-NBDG攝取增加
　　取野生型（WT）及Sm22α-/-小鼠頸總動脈，加入PDGF-BB和2-NBDG共同孵育15 min，制備動脈冰凍切片，觀察動脈組織攝取2-NBDG的熒光強度。結果顯示，Sm22α-/-小鼠頸總動脈在PDGF-BB刺激下，2-NBDG攝取顯著增

14、加，熒光強度明顯高于野生型小鼠的主動脈，這一效應可被GLUT4特異抑制劑indinavir解除。
　　2.3 GLUT4參與Sm22α-/-小鼠損傷后新生內(nèi)膜的形成
　　體外研究已證實GLUT4介導的葡萄糖攝取參與細胞增殖，SM22α缺失可促進這一過程。為了在體內(nèi)驗證這一發(fā)現(xiàn)，選雄性WT及Sm22α-/-小鼠復制左側頸總動脈結扎模型。于結扎術后28天取頸總動脈制備切片。HE染色結果表明，與WT對照組相比，Sm22α-/-小鼠

15、在結扎的第28天血管新生內(nèi)膜明顯增厚。取WT及Sm22α-/-小鼠結扎側頸總動脈進行總蛋白及膜蛋白提取，檢測GLTU4表達。結果表明，相對于WT組，Sm22α-/-小鼠損傷動脈總蛋白和膜組分中GLTU4表達均高于WT小鼠，膜組分與總蛋白GLTU4比值也有所增加。用高效液相色譜法檢測動脈組織中葡萄糖含量，結果發(fā)現(xiàn)， Sm22α-/-小鼠損傷動脈組織葡萄糖含量也明顯高于野生型小鼠，與內(nèi)膜增生程度相一致。以上結果表明，SM22α缺失可促進體內(nèi)

16、GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取，加重內(nèi)膜增生程度。
　　3 SM22α增強血管平滑肌細胞微管穩(wěn)定性
　　3.1 SM22a增強血管平滑肌細胞微管的穩(wěn)定性
　　為檢測SM22α在微管穩(wěn)定性中的作用，用SM22α特異性小干擾RNA（siSM22α）敲低血管平滑肌細胞內(nèi)源性SM22α，α-tubulin抗體進行免疫熒光染色，結果顯示，siCon組微管從核周向細胞邊緣呈放射狀分布；敲低SM22α后，微管解聚并向核周聚集。過表達SM

17、22α的細胞，其微管呈束狀存在。與 WT相比較，Sm22α-/-小鼠細胞微管解聚并向核周聚集；補救SM22α表達后，微管結構恢復至WT狀態(tài)。結果表明，SM22α表達增強微管的穩(wěn)定性。
　　3.2 SM22α增強a-tubulin40位賴氨酸殘基乙酰化
　　α-tubulin第40位賴氨酸殘基乙?；揎検枪J的是微管穩(wěn)定性標志。細胞免疫熒光和Westhern blot結果均表明，敲低SM22α可降低α-tubulin乙酰化水平

18、，而過表達SM22α則增強α-tubulin的乙酰化水平，與SM22α對微管存在形式的影響相一致。
　　3.3敲除SM22α降低生長接觸抑制，促進線粒體分裂和膜電位增加
　　細胞計數(shù)結果顯示，WT組的細胞在融合狀態(tài)下，繼續(xù)培養(yǎng)2，3，4天時，細胞密度無明顯差異；而 Sm22α-/-細胞在2，3，4天后仍保持增殖活性，數(shù)量明顯增加，在第4天時，細胞密度達到WT組的1.68倍。JC-1染色結果表明，WT組細胞線粒體多呈長桿狀、線

19、狀并緊密連接的立體網(wǎng)絡的融合狀態(tài)；而Sm22α-/-細胞線粒體則呈顆粒狀、點狀散在分布的分裂狀態(tài)，而且線粒體膜電位也明顯高于野生型細胞。
　　結論：
　　1 PDGF-BB誘導的GLUT4轉(zhuǎn)位和糖攝取參與血管平滑肌細胞增殖。
　　2缺失SM22α可誘導皮層細胞骨架聚合，增強PDGF-BB誘導的GLUT4膜轉(zhuǎn)位和糖攝取及代謝活性。
　　3 SM22α是一種新的增殖相關糖代謝調(diào)節(jié)因子。
　　4 SM22α增強血