SM22α調(diào)節(jié)GLUT4轉(zhuǎn)位的機(jī)制及其在血管平滑肌細(xì)胞增殖中的意義.pdf

1、目的：糖尿病患者血管成型術(shù)后再狹窄和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率明顯高于正常人。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）增殖需要消耗高水平的葡萄糖，增強(qiáng)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、分解代謝和線粒體生物氧化是增殖的細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的重要特征。
　　葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)介導(dǎo)的葡萄糖攝取是血管平滑肌細(xì)胞糖攝取的主要機(jī)制，GLUT4在損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜中表達(dá)明顯增加。PDGF可通過(guò)激活PI3K促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)位進(jìn)

2、而促進(jìn)葡萄糖攝取，而PI3K激活介導(dǎo)的皮層肌動(dòng)蛋白（actin）重構(gòu)是GLUT4轉(zhuǎn)位所必須的。
　　平滑?。╯mooth muscle，SM)22α,是一種actin細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，其主要功能是與actin結(jié)合，參與血管平滑肌細(xì)胞微絲聚合和骨架重構(gòu)。在血管平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病如動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、腹主動(dòng)脈瘤以及腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。我們先前實(shí)驗(yàn)證明，高表達(dá) SM22α可通過(guò)阻斷PDGF-BB刺激所激活的 Ras-ERK1/2信號(hào)

3、通路，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖,并且，敲低SM22α可引起類似PDGF-BB刺激所產(chǎn)生的actin細(xì)胞骨架的重構(gòu)。但是，SM22α是否參與PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位尚不清楚。本研究旨在探討SM22α在PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位中的作用及其與細(xì)胞增殖活性的關(guān)系，揭示其作用的分子機(jī)制。
　　方法：
　　利用免疫熒光、Western blot技術(shù)檢測(cè)PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位及與細(xì)胞骨架重構(gòu)

4、的關(guān)系；利用熒光葡萄糖2-NBDG檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞及動(dòng)脈葡萄糖攝??；通過(guò)敲低SM22α，確定SM22α參與PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取；通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè) GLUT4介導(dǎo)的葡萄糖攝取與血管平滑肌細(xì)胞增殖的相關(guān)性；利用Sm22α-/-小鼠建立頸總動(dòng)脈損傷模型，用高效液相色譜法檢測(cè)組織葡萄糖含量，結(jié)合膜蛋白提取和Western blot技術(shù)，探討缺失SM22α在GLUT4轉(zhuǎn)位介導(dǎo)的葡萄糖攝取與損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)

5、膜形成之間的關(guān)系。用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)平滑肌細(xì)胞微管的聚合情況；通過(guò)敲低或敲除或用腺病毒過(guò)表達(dá)SM22α，觀察SM22α與微管穩(wěn)定性的關(guān)系；利用Western blot技術(shù)檢測(cè)α-Tubulin乙?；?；用JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位。
　　結(jié)果：
　　1 SM22α通過(guò)調(diào)節(jié)微絲骨架重構(gòu)參與PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位和糖攝取
　　1.1 PDGF-BB誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取
　　PDG

6、F-BB刺激血管平滑肌細(xì)胞0、5、10、15、20、30 min，提取膜蛋白，Western blot方法檢測(cè)膜上GLUT4的表達(dá)量。結(jié)果顯示，PDGF-BB刺激可誘導(dǎo)GLUT4向膜上轉(zhuǎn)位，膜組分中GLUT4含量于15 min達(dá)到峰值，隨后下降。熒光葡萄糖2-NBDG攝取實(shí)驗(yàn)顯示，用PDGF-BB處理的細(xì)胞其2-NBDG的攝取也在15 min達(dá)到峰值，變化趨勢(shì)與GLUT4膜轉(zhuǎn)位一致，提示細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取增加。
　　1.2肌動(dòng)蛋白

7、重構(gòu)調(diào)節(jié)PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位
　　細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜上GLUT4的表達(dá)和細(xì)胞骨架的變化。結(jié)果顯示，PDGF-BB刺激15 min,隨著細(xì)胞骨架重構(gòu)，皮層F-actin聚合增加，GLUT4從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞邊緣，與細(xì)胞皮層聚合的F-actin發(fā)生共定位。而用細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑 JPK預(yù)處理細(xì)胞后，PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架解聚和皮層F-actin聚合受抑制，同時(shí)GLUT4膜轉(zhuǎn)位明顯減少。2-NBDG攝取分析也顯示用

8、JPK預(yù)處理后，PDGF-BB刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖攝取被抑制。以上結(jié)果表明，PDGF-BB誘導(dǎo)的 GLUT4膜轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取依賴于細(xì)胞骨架重構(gòu)。
　　1.3 SM22α抑制GLUT4膜轉(zhuǎn)位
　　用SM22α特異性小干擾RNA（siSM22α）敲低血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性SM22α，鬼筆環(huán)肽熒光染色觀察PDGF-BB刺激前后細(xì)胞骨架的變化。結(jié)果顯示，相對(duì)于siCon組，敲低SM22α后，血管平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下應(yīng)力纖維

9、密度明顯減少，而PDGF-BB刺激引起的皮層F-actin聚合則更加明顯。同時(shí)，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，敲低SM22α后PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位也明顯增加。Western blot方法檢測(cè)膜蛋白提取物中GLUT4的含量也得到相似結(jié)果。進(jìn)一步用Sm22α-/-小鼠的細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，與野生型（WT）相比較，PDGF-BB誘導(dǎo)的Sm22α-/-小鼠的細(xì)胞皮層F-actin聚合和GLUT4轉(zhuǎn)位均明顯增加。以上結(jié)果證實(shí)了我們的假設(shè)，下調(diào)SM

10、22α通過(guò)增強(qiáng)actin動(dòng)力學(xué)和皮層F-actin聚合從而促進(jìn)PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位。
　　1.4下調(diào)SM22α表達(dá)可促進(jìn)PDGF-BB誘導(dǎo)的葡萄糖攝取和代謝利用
　　分別檢測(cè)敲低SM22α的大鼠VSMC及Sm22α-/-小鼠細(xì)胞PDGF-BB誘導(dǎo)的熒光葡萄糖2-NBDG的攝取情況。結(jié)果顯示，敲低或敲除SM22α可促進(jìn)PDGF-BB誘導(dǎo)的2-NBDG攝取，與相同條件下GLUT4轉(zhuǎn)位增強(qiáng)相一致。而用GLUT4活性抑

11、制劑Indinavir預(yù)孵育后，PDGF-BB誘導(dǎo)的2-NBDG攝取增加受到抑制，說(shuō)明GLUT4是糖攝取的主要載體。相對(duì)于siCon組，用小干擾RNA敲低SM22α表達(dá)，可增強(qiáng)PDGF-BB誘導(dǎo)的己糖激酶和乳酸脫氫酶活性。以上結(jié)果表明，PDGF-BB可加速細(xì)胞糖代謝，SM22α缺失能夠促進(jìn)這一過(guò)程。
　　2敲除SM22α通過(guò)加速葡萄糖攝取而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖
　　2.1 GLUT4及其介導(dǎo)的葡萄糖攝取參與PDGF-BB誘

12、導(dǎo)的細(xì)胞增殖
　　用C57BL/6J野生型小鼠復(fù)制左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型。HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，結(jié)扎的血管新生內(nèi)膜明顯增厚；組織免疫熒光染色結(jié)果也表明，新生內(nèi)膜處GLUT4表達(dá)顯著增加。體外研究顯示，PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4表達(dá)，呈時(shí)間依賴性；同時(shí)伴隨細(xì)胞核增殖性抗原PCNA表達(dá)的增加。在相同刺激條件下，細(xì)胞培養(yǎng)基（低糖DMEM）中葡萄糖消耗也明顯增加。細(xì)胞計(jì)數(shù)和BrdU分析結(jié)果顯示，抑制GLUT4活性的細(xì)胞其增殖

13、活性顯著降低。以上結(jié)果表明，在PDGF-BB刺激下，GLUT4表達(dá)及其介導(dǎo)的葡萄糖攝取參與了細(xì)胞增殖。
　　2.2 Sm22α-/-小鼠主動(dòng)脈GLUT4介導(dǎo)的2-NBDG攝取增加
　　取野生型（WT）及Sm22α-/-小鼠頸總動(dòng)脈，加入PDGF-BB和2-NBDG共同孵育15 min，制備動(dòng)脈冰凍切片，觀察動(dòng)脈組織攝取2-NBDG的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，Sm22α-/-小鼠頸總動(dòng)脈在PDGF-BB刺激下，2-NBDG攝取顯著增

14、加，熒光強(qiáng)度明顯高于野生型小鼠的主動(dòng)脈，這一效應(yīng)可被GLUT4特異抑制劑indinavir解除。
　　2.3 GLUT4參與Sm22α-/-小鼠損傷后新生內(nèi)膜的形成
　　體外研究已證實(shí)GLUT4介導(dǎo)的葡萄糖攝取參與細(xì)胞增殖，SM22α缺失可促進(jìn)這一過(guò)程。為了在體內(nèi)驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，選雄性WT及Sm22α-/-小鼠復(fù)制左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型。于結(jié)扎術(shù)后28天取頸總動(dòng)脈制備切片。HE染色結(jié)果表明，與WT對(duì)照組相比，Sm22α-/-小鼠

15、在結(jié)扎的第28天血管新生內(nèi)膜明顯增厚。取WT及Sm22α-/-小鼠結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行總蛋白及膜蛋白提取，檢測(cè)GLTU4表達(dá)。結(jié)果表明，相對(duì)于WT組，Sm22α-/-小鼠損傷動(dòng)脈總蛋白和膜組分中GLTU4表達(dá)均高于WT小鼠，膜組分與總蛋白GLTU4比值也有所增加。用高效液相色譜法檢測(cè)動(dòng)脈組織中葡萄糖含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Sm22α-/-小鼠損傷動(dòng)脈組織葡萄糖含量也明顯高于野生型小鼠，與內(nèi)膜增生程度相一致。以上結(jié)果表明，SM22α缺失可促進(jìn)體內(nèi)

16、GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取，加重內(nèi)膜增生程度。
　　3 SM22α增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞微管穩(wěn)定性
　　3.1 SM22a增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞微管的穩(wěn)定性
　　為檢測(cè)SM22α在微管穩(wěn)定性中的作用，用SM22α特異性小干擾RNA（siSM22α）敲低血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性SM22α，α-tubulin抗體進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，siCon組微管從核周向細(xì)胞邊緣呈放射狀分布；敲低SM22α后，微管解聚并向核周聚集。過(guò)表達(dá)SM

17、22α的細(xì)胞，其微管呈束狀存在。與 WT相比較，Sm22α-/-小鼠細(xì)胞微管解聚并向核周聚集；補(bǔ)救SM22α表達(dá)后，微管結(jié)構(gòu)恢復(fù)至WT狀態(tài)。結(jié)果表明，SM22α表達(dá)增強(qiáng)微管的穩(wěn)定性。
　　3.2 SM22α增強(qiáng)a-tubulin40位賴氨酸殘基乙?；?br>　　α-tubulin第40位賴氨酸殘基乙?；揎検枪J(rèn)的是微管穩(wěn)定性標(biāo)志。細(xì)胞免疫熒光和Westhern blot結(jié)果均表明，敲低SM22α可降低α-tubulin乙?；?/p>

18、，而過(guò)表達(dá)SM22α則增強(qiáng)α-tubulin的乙酰化水平，與SM22α對(duì)微管存在形式的影響相一致。
　　3.3敲除SM22α降低生長(zhǎng)接觸抑制，促進(jìn)線粒體分裂和膜電位增加
　　細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，WT組的細(xì)胞在融合狀態(tài)下，繼續(xù)培養(yǎng)2，3，4天時(shí)，細(xì)胞密度無(wú)明顯差異；而 Sm22α-/-細(xì)胞在2，3，4天后仍保持增殖活性，數(shù)量明顯增加，在第4天時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)到WT組的1.68倍。JC-1染色結(jié)果表明，WT組細(xì)胞線粒體多呈長(zhǎng)桿狀、線

19、狀并緊密連接的立體網(wǎng)絡(luò)的融合狀態(tài)；而Sm22α-/-細(xì)胞線粒體則呈顆粒狀、點(diǎn)狀散在分布的分裂狀態(tài)，而且線粒體膜電位也明顯高于野生型細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1 PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位和糖攝取參與血管平滑肌細(xì)胞增殖。
　　2缺失SM22α可誘導(dǎo)皮層細(xì)胞骨架聚合，增強(qiáng)PDGF-BB誘導(dǎo)的GLUT4膜轉(zhuǎn)位和糖攝取及代謝活性。
　　3 SM22α是一種新的增殖相關(guān)糖代謝調(diào)節(jié)因子。
　　4 SM22α增強(qiáng)血