人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白-順鉑的質(zhì)譜與波譜特性及其靶向誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機制.pdf

1、外科治療，放射性治療(放療)，化學(xué)藥物治療(化療)、和免疫(生物)治療是目前癌癥治療的四大主要手段，其中化療法具有能進(jìn)行全身性癌癥治療、多發(fā)性癌癥治療、以及癌癥根治率相對較高等優(yōu)點，成為應(yīng)用最廣泛、發(fā)展最快的治療手段。但是，傳統(tǒng)的化療藥物都不能特異性的殺傷癌細(xì)胞，化療效果和嚴(yán)重毒副作用并存。療效依賴于藥物毒性、給藥劑量、給藥途徑、給藥次數(shù)和療程的各種化療藥物均具有細(xì)胞毒性極強、給藥劑量大，并易產(chǎn)生耐藥性等缺陷，給化療患者帶來難以忍受的痛

2、苦。近十年來，高效靶向化療成為腫瘤治療學(xué)的研究熱點之一，在組織器官水平、細(xì)胞水平和分子水平上的靶向治療都有大量的研究報道，部分研究成果已應(yīng)用于臨床治療。
　　 本文通過小批量制備人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Human serum transferrin，HTF)，通過質(zhì)譜與波譜特性研究了HTF絡(luò)合順鉑(Cis-diamminedichloroplatinum，cisplatin/CDDP)能力，構(gòu)建了HTF-CDDP運輸載體，并在體外考察了

3、HTF-CDDP細(xì)胞水平的靶向能力，在昆明小鼠體內(nèi)考察了HTF-CDDP組織器官水平的靶向能力。通過篩選與鑒定HTF-CDDP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的差異蛋白質(zhì)，深入了解HTF-CDDP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞對CDDP產(chǎn)生耐藥性的分子機理，為HTF-CDDP在分子水平靶向凋亡腫瘤細(xì)胞的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，同時也為傳統(tǒng)化療藥物治療腫瘤疾病提供新思路、新途徑和新穎分析技術(shù)，立題研究具有重要的科學(xué)意義，和潛在應(yīng)用價值，主要研究內(nèi)容如下：
　　

4、 第一：HTF制備及異構(gòu)體分析
　　 采用線性梯度和均勻天然聚丙烯胺凝膠電泳聯(lián)用的兩次電泳技術(shù)小批量制備HTF。選用反相液相色譜法(Reverse phase high performance liquidchromatography，RP-HPLC)、陰離子交換色譜法、等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳法(Isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis，IEF-PAGE

5、)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)、肽質(zhì)量指紋圖譜技術(shù)(Peptide mass fingerprinting，PMF)等進(jìn)行HTF及異構(gòu)體組成分析。結(jié)果表明RP-HPLC和IEF-PMF聯(lián)用技術(shù)是最有效的HTF異構(gòu)體組成分析方法，發(fā)現(xiàn)HTF由asial

6、otransferrin、monosialotransferrin、disialotransferrin、trisialotransferrin、tetrasialotransferrin、pentasialotransferrin、hexasialotransferrin、septimsialotransferrin等8個糖鏈缺失異構(gòu)體，和HTF-Dchi、HTf-C1、HTf-B2等三個遺傳型異構(gòu)體組成，其中HTF-C1型是主要遺傳

7、型異構(gòu)體，占所有遺傳型異構(gòu)體的95％以上，而帶4個糖鏈分支的tetrasialotransferrin異構(gòu)體占HTF總量的80％左右，是糖鏈缺失HTF的主要異構(gòu)體。
　　 第二：HTF絡(luò)合CDDP能力的研究
　　 選用圓二色譜(Circular dichroism spectrum，CD)、熒光光譜(Fluorescencespectrum，F(xiàn)S)、紅外光譜(Infrared spectrum，IR)、電感耦合等離子體質(zhì)

8、譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)等分析方法研究不同pH值條件下，HTF結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換趨勢和絡(luò)合CDDP能力。在酸性條件下，反應(yīng)體系的pH值越低，HTF的結(jié)構(gòu)越松散：當(dāng)pH<3.5時，HTF分子結(jié)構(gòu)會發(fā)生不可逆的變化，但在pH3.5-7.25范圍內(nèi)，其分子結(jié)構(gòu)隨pH的變化呈現(xiàn)不同的開放程度。三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)能改善HTF絡(luò)合CD

9、DP的能力，其絡(luò)合CDDP數(shù)目依賴于反應(yīng)體系的pH值。建立pH影響HTF絡(luò)合CDDP能力的反應(yīng)模型，構(gòu)建HTF-CDDP復(fù)合物，其絡(luò)合CDDP數(shù)量可高達(dá)10 CDDP/HTF。
　　 第三：HTF-CDDP靶向HepG2腫瘤細(xì)胞能力及其誘導(dǎo)凋亡的分子機制的研究
　　 通過FITC標(biāo)記HTF-CDDP靶向運輸載體，激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)分析HTF-CDDP靶向及胞飲進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力，ICP-MS技術(shù)分析HTF-CDDP

10、在細(xì)胞內(nèi)外釋放CDDP的情況，流式細(xì)胞術(shù)分析HTF-CDDP靶向腫瘤細(xì)胞引起腫瘤凋亡的效果，蛋白質(zhì)組學(xué)及Realtime-PCR技術(shù)分析CDDP與HTF-CDDP凋亡HepG2細(xì)胞的分子機制差異性等途徑，研究CDDP和給藥途徑對HepG2肝癌耐藥性產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，HTF-CDDP能夠有效的的靶向腫瘤細(xì)胞，并與holo-HTF競爭性地與TFR識別與結(jié)合，通過胞飲途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)釋放CDDP，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，說明HTF-CDDP靶向運

11、輸載體能在細(xì)胞水平上有效的靶向凋亡腫瘤細(xì)胞。Apo-HTF-CDDP和CDDP誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機制存在差異，主要表現(xiàn)在對ATM/ATR、P73、Akt、BAD、P27、mTOR、GADD45A、53BP1、PCNA和Rad51等關(guān)鍵蛋白/激酶的影響上。同時發(fā)現(xiàn)ATM、ATR、Akt等蛋白質(zhì)是細(xì)胞應(yīng)對CDDP引起DNA損傷后的重要反應(yīng)蛋白，如何通過抑制這些蛋白的功能，來提高CDDP等DNA毒性化療藥物的抗癌療效值得深入研究。

12、　　 第四：TF-CDDP在昆明小鼠體內(nèi)分布情況
　　 構(gòu)建昆明小鼠血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Mouse serum transferrin，MSTF)-CDDP，并研究MSTF-CDDP和CDDP在昆明小鼠各器官中的分布規(guī)律與代謝趨勢。在給藥后1、3、8、16、24、72h分離昆明小鼠血清、血細(xì)胞、肝臟、腎臟、脾臟、肺、心、腦、脊髓和腫瘤等組織，濃硝酸充分消解后用ICP-MS檢測各組織的CDDP濃度，分析CDDP和MSTF-CDDP在昆

13、明小鼠體內(nèi)分布與代謝情況，同時以組織切片技術(shù)和透射電鏡技術(shù)分析CDDP和MSTF-CDDP處理下的腎臟損傷情況。結(jié)果表明，pH調(diào)節(jié)血清轉(zhuǎn)鐵蛋白絡(luò)合CDDP數(shù)量的反應(yīng)模型同樣適合于MSTF與CDDP的絡(luò)合，成功構(gòu)建了絡(luò)合10個左右CDDP分子的MSTF-CDDP靶向運輸載體；MSTF-CDDP能夠通過內(nèi)吞小泡的形式進(jìn)入細(xì)胞中，表明MSTF-CDDP能夠有效的與細(xì)胞表面受體結(jié)合，并通過TF-TFR胞飲傳遞系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步證明MSTF-

14、CDDP靶向運輸?shù)目赡苄?；MSTF-CDDP能減少CDDP在血細(xì)胞中的滯留，是有效提高CDDP藥效和降低血液毒性的途徑之一；MSTF-CDDP在昆明小鼠體內(nèi)能夠富集于腫瘤組織及大部分內(nèi)臟器官中，并在內(nèi)臟器官、腫瘤組織內(nèi)維持更長時間的高藥物濃度，尤其是在肝臟和脾臟組織中，但沒有表現(xiàn)出在腦部和脊髓中的富集，不會增強其神經(jīng)毒性；同時MSTF-CDDP也沒有明顯的腎臟毒性提高的表現(xiàn)，表明MSTF-CDDP能夠在相對低血藥濃度(低毒副作用)條件下