線粒體融合蛋白2誘導肝癌細胞凋亡的分子機制的研究.pdf

1、肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，目前占我國惡性腫瘤死亡原因的第二位，肝癌早期往往不易發(fā)現，一旦發(fā)現多數已屬中晚期，如果不能徹底手術切除，目前仍缺乏其他有效的治療方法。通過各種手段干預腫瘤細胞的活化增殖，是目前治療肝癌的研究方向和研究熱點。腫瘤的形成多與失控的細胞增殖相關，而細胞凋亡在這種病態(tài)的增殖密切相關。細胞增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene，HSG)是利用差異顯示技術得到的一個與高血壓相關的新基因，最

2、近研究發(fā)現HSG與線粒體融合相關，因此被稱為線粒體融合蛋白2(Mfn2)。研究表明，Mfn2通過與ras基因結合，抑制Ras-Erk通路的活性，從而上調周期調控蛋白P27和P21Cipl的表達、下調PCNA的表達、阻滯細胞于G0/G1期，從而抑制細胞增殖，提示Mfn2可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。
　　第一部分線粒體融合蛋白2(Mfn2)通過線粒體凋亡途徑誘導肝癌細胞凋亡
　　目的:
　　Mfn2顯著抑制血管內皮細胞(V

3、SMCs)增殖，并具有潛在的誘導細胞凋亡效應。本文證實Mfn2誘導肝癌細胞凋亡并探討其可能的分子機制。
　　方法:
　　運用QRT-PRC和免疫組化分析肝癌與癌旁正常肝組織Mfn2基因與蛋白表達水平。本研究采用肝癌細胞株HepG2與Huh7細胞，運用腺病毒載體外源性加入重組的Mfn2，建立過表達Mfn2的細胞模型。應用流式細胞術分析Mfn2對細胞凋亡、線粒體膜電位、活性氧水平的影響，運用Western blot方法檢測細胞色

4、素c釋放、Bax移位和活化的Caspase3表達，并探討其誘導細胞凋亡的分子機制。
　　結果:
　　定量PCR和免疫組化顯示，與癌旁正常肝組織相比，癌組織中Mfn2在基因與蛋白水平均低表達(P＜0.01)。免疫組化顯示，Mfn2的低表達與腫瘤的大小及分期密切相關(P=0.038和0.040)。生存曲線表明低表達Mfn2的肝癌病人預后較差(P＜0.01)。
　　肝癌細胞株HepG2與Huh7過表達Mfn2，發(fā)現細胞凋亡、

5、線粒體膜電位(△Ψm)下降、細胞內活性氧水平(ROS)增加、Bax由細胞質易位于線粒體而細胞色素c由線粒體釋放入細胞質。
　　結論:
　　Mfn2在癌組織中低表達，與腫瘤大小、分期及病人生存率密切相關。發(fā)現Mfn2可能通過線粒體凋亡途徑誘導肝癌細胞凋亡。
　　第二部分線粒體融合蛋白2(Mfn2)通過激發(fā)內質網(ER)內鈣離子(Ca2+)流入線粒體從而誘導肝癌細胞凋亡
　　目的:
　　Mfn2顯著抑制細胞增殖

6、并具有誘導肝癌細胞凋亡效應。另外，Mfn2不但促進線粒體融合并維持線粒體的網絡結構，而且是維持線粒體與內質網(ER)緊密聯系的橋梁蛋白。本研究探討Mfn2可能通過激發(fā)內質網內鈣離子流入線粒體從而誘導肝癌細胞凋亡。
　　方法:
　　應用肝癌細胞株HepG2，通過腺病毒載體外源性加入Mfn2，建立過表達Mfn2的細胞模型。運用鈣離子示蹤劑，檢測內質網與線粒體內鈣離子的變化。另外，分別應用藥物肝素(Heparin)（特異性抑制內質

7、網上IP3激活的鈣離子釋放通道）和RU360（特異性阻斷線粒體鈣離子攝入）處理過表達Mfn2的細胞，分析細胞內細胞器的鈣離子流向并檢測細胞凋亡、線粒體膜電位、活性氧水平和細胞色素c釋放。
　　結果:
　　在Mfn2的外源性處理下，內質網(ER)內鈣離子下降、線粒體內鈣離子增加。然而，運用Heparin和RU360處理過表達Mfn2的HepG2細胞，發(fā)現細胞不發(fā)生凋亡、線粒體膜電位(△Ψm)不下降、活性氧水平(ROS)不升高、