丹皮酚誘導(dǎo)人肝癌細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、背景：肝細胞性肝癌（HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率為30.3/10萬，占所有癌癥的13.13％，居第3位，近二十年來，死亡率增加了41.7％，約占全世界HCC死亡人數(shù)的42％。近年來，由于丙型肝炎病毒感染增加，肝癌的發(fā)病率在發(fā)達國家也有上升的趨勢。目前，手術(shù)切除仍是治療HCC的最佳手段。但是80％的患者在診斷時已屬晚期，失去手術(shù)機會，而對于那些手術(shù)患者，其兩年內(nèi)的復(fù)發(fā)率也高達50％。全身性化療是治療肝癌尤其是無手術(shù)指征的晚期

2、肝癌的重要方法，但現(xiàn)有的化療藥物，不論是單藥治療還是多藥聯(lián)合治療療效均不理想。因此，探求新的有價值治療手段和策略顯得十分必要。從中藥和其他天然產(chǎn)物中尋求高效、低毒的新型抗肝癌藥物并深入探討其抗腫瘤機制是當(dāng)前國內(nèi)外研究的重要課題。丹皮酚（Paeonol，Pae）又稱牡丹酚，是我省道地中藥材毛莨科植物牡丹Paeonia Suffruicosa Andr根皮和蘿摩科植物徐長卿 Pycnostelma Paniculatum (Bunge) K

3、.Schum 干燥根或全草的主要有效成分，具有鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)及保護心腦血管等廣泛的藥理活性。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Pae對體內(nèi)培養(yǎng)的多種腫瘤細胞的增殖有較強的抑制作用，體內(nèi)應(yīng)用有抗腫瘤作用。此外，我們也發(fā)現(xiàn)Pae能增強順鉑對人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721和人食管癌細胞Eca-109、SEG-1的增殖抑制作用。本研究選用人肝癌細胞株HepG2、Bel-7402作為實驗對象，通過觀察Pae對人肝癌細胞株HepG2、B

4、el-7402的COX-2、Survivin、Ciap-1、XIAP表達的影響，探討其可能的作用機制，以期為肝癌的臨床治療提供新的方法。
　　 目的：探討Pae誘導(dǎo)人肝癌細胞HepG2、Bel-7402凋亡的分子機制。
　　 方法：采用MTT法測定Pae對HepG2、Bel-7402細胞的增殖抑制率；流式細胞儀檢測細胞凋亡；原位細胞凋亡檢測法觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；Western-blot方法及免疫細胞化學(xué)分析COX-2

5、、Ciap-1、XIAP、Survivin變化。
　　 結(jié)果：⑴采用MTT法，觀察Pae對HepG2細胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示（1）Pae7.81～62.5mg/L對HepG2細胞有增殖抑制作用，藥物濃度越高，抑制作用越強。（2）系列濃度Pae作用于肝癌細胞HepG2 24h、48h及72h后觀察細胞的生長情況，結(jié)果顯示Pae作用時間越長，對HepG2細胞的抑制作用越強。⑵采用MTT法，觀察Pae對Bel-7402細胞的增殖抑

6、制作用。結(jié)果顯示（1）Pae7.81～62.5mg/L對Bel-7402細胞有增殖抑制作用，藥物濃度越高，抑制作用越強。（2）系列濃度Pae作用于肝癌細胞Bel-7402 24h、48h及72h后觀察細胞的生長情況，結(jié)果顯示Pae作用時間越長，對Bel-7402細胞的抑制作用越強。⑶采用末端雙脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的Dutp缺口標(biāo)記技術(shù)（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated Dutp

7、 nick-end labeling，TUNEL)觀察HepG2、Bel-7402細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。典型的凋亡細胞形態(tài)特征包括核固縮、體積縮小、核染色質(zhì)邊集等。研究發(fā)現(xiàn)對照組細胞增殖旺盛，可見少許凋亡細胞；藥物作用細胞48h后，細胞密度均明顯減少，凋亡細胞數(shù)明顯增加。⑷應(yīng)用流式細胞儀（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測細胞凋亡率。在DNA圖譜G0/G1期前出現(xiàn)了一個代表細胞凋亡的亞G1峰即凋亡峰。FCM結(jié)果顯示，正常對照組可

8、見低矮的凋亡峰，藥物處理48h后，其凋亡峰增加。Pae7.81～62.5mg/L作用HepG2細胞株時，凋亡率分別為：（2.3±1.8）％、（15.6±3.2）％、（27.6±3.9）％（33.2±2.7）％、（45.3±1.7）％；Pae7.81～62.5mg/L作用Bel-7402細胞株時，凋亡率分別為：（1.8±1.2）％、（12.5±3.1）％、（25.1±4.2）％、（37.5±3.7）％、（50.3±4.5）％。⑸采用Wes