活血與清熱藥物組分配伍對(duì)高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的影響.pdf

1、目的：
　　 活血與清熱類中藥是治療糖尿病血管并發(fā)癥的兩類常用的藥物,活血化瘀類藥物以丹參、三七為代表,清熱類中藥以黃連為代表。本研究選取這三種代表性藥物的主要組分:丹參酚酸B(D)、三七總皂甙(S)、黃連總生物堿(H),通過(guò)觀察三者配伍對(duì)高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管活性物質(zhì)及核因子-κB表達(dá)的影響,探討三種中藥組分配伍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能、血管舒縮及相關(guān)纖溶系統(tǒng)的作用,闡釋中醫(yī)藥保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用機(jī)理,以期為中藥防治糖尿病

2、血管并發(fā)癥提供基礎(chǔ)研究支撐。
　　 方法：
　　 (1)建立高糖損傷的內(nèi)皮細(xì)胞模型:采用原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,分別采用葡萄糖濃度為5.5、15、30mmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞6、12、24、36、48h,采用MTT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力,選擇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制作用較強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)和糖濃度,作為最佳的高糖損傷成模條件。
　　 (2)篩選三種配伍藥物組分的干預(yù)應(yīng)用濃度:分別采用不同濃度的三種中藥有效組分,干預(yù)內(nèi)皮細(xì)

3、胞,其中丹參酚酸B(D)濃度采用0、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、0.5、1mg/ml,三七總皂苷(S)濃度采用0.05、0.1、0.2、0.4mg/ml,黃連總生物堿(H)濃度采用0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20mg/l,分別培養(yǎng)48h后,MTT檢測(cè)細(xì)胞活力,篩選三種藥物組分濃度的大、中、小三個(gè)有效劑量。
　　 (3)三種藥物組分配伍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力的影響:分別采用三

4、種藥物組分的有效劑量作為最終濃度,進(jìn)行組分配伍,分為D、S、H、DS、DH、SH、DSH七個(gè)藥物組,對(duì)高糖模型的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),培養(yǎng)48h后,MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。
　　 (4)三種藥物組分配伍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能及其調(diào)控:D、S、H、DS、DH、SH、DSH七個(gè)藥物組,對(duì)高糖模型的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),培養(yǎng)48h后,亞硝酸還原酶法檢測(cè)培養(yǎng)上清中NO,比色法檢測(cè)上清中NOS活力及其分型,ELISA檢測(cè)上清中t-PA、PAI-1、P

5、GI2,放射免疫法檢測(cè)上清中ET-1、ANG-Ⅱ、TXB2,RT-PCR檢測(cè)ET-1mRNA和eNOSmRNA的表達(dá),Western blot檢測(cè)核因子-κB(NF-κB)P65蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)高糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型:內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)5.5、15、30mmol/L糖濃度培養(yǎng)48h后,細(xì)胞增殖活力差別最大,高糖1組(HG1,15mmol/L)較正常組(ZC,5.5mmol/L)顯著下降(P=0.006),下

6、降約5.522％,高糖2組(HG2,30mmol/L)較正常組顯著下降(P=0.000),下降約12.835％,并且HG2組細(xì)胞活力顯著低于HG1組(P=0.001)。因此,采用30mmol/L高糖培養(yǎng)48h作為最佳成模條件。
　　 (2)三種藥物組分濃度:丹參酚酸B(D)濃度為0.02mg/ml-0.1mg/ml促進(jìn)細(xì)胞增殖,濃度達(dá)到0.1mg/ml以上時(shí),細(xì)胞活力降低。三七總皂甙(S)濃度為50-400mg/ml,細(xì)胞增殖活

7、性均增高,以100mg/ml最為明顯。黃連總生物堿(H)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有抑制作用,并隨濃度的增加,抑制作用增強(qiáng)。因此,D選擇中等劑量0.04mg/ml,S選用促增殖最為明顯的0.1mg/ml,H選用抑制細(xì)胞增殖最弱的0.02mg/L。
　　 (3)三種藥物組分配伍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力的影響:三種藥物組分及其配伍組(D、S、H、DS、DH、SH、DSH)均有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,其中以DSH增殖效應(yīng)最明顯,促增殖作用從強(qiáng)到弱依次為:

8、DSH>D>S>DS>H>DH>SH,DSH組較HG組增殖活力提高了36.997％。
　　 (4)三種藥物組分配伍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能及其調(diào)控的作用:藥物組分配伍能有效提高高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌(P<0.05),提高培養(yǎng)上清中TNOS的活力,降低iNOS活力,抑制ET-1的分泌,其中以DSH組作用最為顯著。藥物組份配伍對(duì)ANG—Ⅱ的抑制作用以SH最為顯著。DS組與S能有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌PAI-1(P<0.05),以DS抑制

9、作用最為明顯,而D、H則無(wú)明顯作用。以DS組對(duì)PAI-1的抑制作用最明顯。D、H、SH組具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌t-PA的作用(P<0.05),以SH促分泌作用顯著,S對(duì)t-PA的調(diào)節(jié)作用不顯著。D、S、DSH組對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著促進(jìn)PGI2分泌的作用(P<0.05),以DSH組促分泌作用最明顯,其次為D。藥物組分配伍能有效降低TXB2的濃度,其中以含有的D的藥物作用最強(qiáng)。
　　 D對(duì)ET-1mRNA具有明顯的抑制作用(P=0.00

10、0),S和H對(duì)ET-1的調(diào)節(jié)作用不明顯,但S和H之前存在交互作用(P=0.010),能起到協(xié)同增效的作用,從而顯著抑制ET-1mRNA的表達(dá)。D、S、H三種組分之間也存在交互作用(P=0.025),當(dāng)三種藥物同時(shí)組合應(yīng)用時(shí)抑制ET-1mRNA表達(dá)的作用最為顯著。藥物促進(jìn)高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞NOS3的表達(dá)(P=0.007),各組NOS3mRNA表達(dá)的從高到低依次是ZC>S>DSH>H>SH>D>HG>DS>DH。
　　 結(jié)論：