豬印記基因的分離、印記鑒定及甲基化分析.pdf

1、印記基因是指基因的表達具有親本選擇性，即只有父本或母本的等位基因表達而另一親本的等位基因不表達或很少表達的一類基因。對哺乳動物的研究表明，印記基因在胎兒、胎盤的生長發(fā)育及胎兒出生后的表現(xiàn)等方面，都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。目前，對基因組印記的研究主要集中在人和小鼠中，在家畜特別是豬中研究比較少。因此，在豬中鑒定印記基因?qū)τ谘芯炕蚪M印記在物種間的保守性和印記基因的功能都具有重要意義。 本研究主要利用大梅、梅大豬及其親本，通過RT-P

2、CR-RFLP分析和PCR產(chǎn)物直接測序法檢測“表達的SNP”，鑒定了豬4個候選印記基因的印記狀態(tài)，以期探討基因組印記在豬與其他物種間的保守性；在大白豬×梅山豬F2代群體中，利用PCR-RFLP技術(shù)，對2個候選印記基因進行基因型與重要經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析，以期探討印記基因在育種中作為分子標(biāo)記的可行性；對豬中2個候選基因中存在的CpG島在各組織中進行甲基化分析；利用AMD方法在二月齡大白、梅山、大梅和梅大豬肌肉組織中篩選印記基因，對差異表達的

3、EST利用“表達的SNP”進行印記驗證。主要結(jié)果如下： 1.根據(jù)人和小鼠印記基因的印記狀況及生理功能，篩選ASCL2，NNAT、DIRAS3和DLX5基因作為豬候選印記基因。利用電子克隆和比較基因組學(xué)方法獲得4個候選印記基因的cDNA序列，均包括完整的開放閱讀框(Openreadingframe，ORF)；(1)ASCL2，獲得cDNA序列1654bp，其中為ORF582bp，GenBank登錄號為DQ666420；(2)NNA

4、T，獲得DNA序列2234bp，GenBank登錄號為DQ666422，該基因包含兩個轉(zhuǎn)錄本，兩者的區(qū)別在于第二外顯子的有無；(3)DIRAS3，獲得cDNA序列1227bp，開放閱讀框為687bp，GenBank登錄號為DQ666421:(4)DLX5，獲得DNA序列4108bp，開放閱讀框為687bp，GenBank登錄號為EU168272。豬4個候選印記基因cDNA序列與人同源序列的相似性均比與鼠同源序列的相似性高，在進化關(guān)系上，

5、豬與人相近而與鼠則較遠。 2.利用大白豬×梅山豬和梅山豬×大白豬正反交模型，通過RT-PCR-RFLP分析和PCR產(chǎn)物直接測序法，鑒定了4個候選印記基因在二月齡豬13個組織和器官中的印記狀況。(1)ASCL2基因在肌肉、脂肪、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、子宮、卵巢和垂體中均逃脫印記；(2)NNAT基因兩個轉(zhuǎn)錄本在肌肉、脂肪、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、子宮、卵巢和垂體中均為母系印記；(3)DIRAS3基因在肌肉、脂肪、心、肝

6、、脾、肺、腎、胃、小腸、子宮、卵巢和垂體中母系印記；(4)DLX5基因在骨骼肌、脂肪、肺、脾、胃和小腸中表達母本來源的等位基因，即表現(xiàn)為父系印記：而在心、肝、腎、子宮、卵巢、睪丸和垂體中表達雙親來源的等位基因，即逃脫印記。 3.利用PCR-RFLP技術(shù)，對2個候選印記基因中存在的SNP位點在不同豬群中進行基因分型，并在大白×梅山F2代群體中進行性狀關(guān)聯(lián)分析.結(jié)果表明：(1)ASCL2基因，C1556G位點多態(tài)性與瘦肉率、肥肉率和

7、瘦肥比率的相關(guān)性達到極顯著水平(p<0.01)，與內(nèi)脂率、股二頭肌pH值和背最長肌pH值的相關(guān)性達到顯著水平(p<0.05)；(2)DLX5基因，C300T位點多態(tài)性與6-7肋問背膘厚、胸腰椎間膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚、肥肉率、胴體長和骨率的相關(guān)性達到極顯著水平(p<0.01)。 4.DIRAS3基因第一外顯子CpG島的父本等位基因各CG位點甲基化水平整體比較低，但各組織間又有其特點：例如肌肉和肝臟中特定位點甲基化，在41個

8、CG位點中肌肉組織偏向CG19、CG35甲基化，肝臟中偏向CG25、CG34甲基化，其他位點非甲基化；睪丸組織中41個位點中全是非甲基化；子宮組織中所有克隆子甲基化水平偏向兩個極端；脾臟和腎臟中隨機甲基化。而DLX5基因第一外顯子CpG島的所有CG位點都呈現(xiàn)非甲基化狀態(tài)。 5.利用24條隨機引物和12條半錨定引物配對擴增，篩選到9條符合條件的EST(即在一個親本和一個子代中表達，而在另一個親本和另一個子代中不表達)，對符合條件的

9、EST利用“表達的SNP”進行印記驗證，結(jié)果表明ACTN3基因為非印記基因。CA3基因的表達模式分為以下四種：在卵巢中表現(xiàn)為印記，大梅雜合子個體表達與其母本一致的G等位基因，梅大雜合子個體表達與其母本一致的A等位基因；在肺臟和心臟中表達雙親來源的等位基因，即逃脫印記；肌肉、脂肪、子宮和睪丸中差異表達大白的等位基因，大梅雜合子個體在這些組織中表達A等位基因，即父本大白的等位基因，而梅大雜合子個體肌肉、脂肪、子宮和睪丸中也表達A等位基因，即