抗神經(jīng)生長因子微球局部植入對哮喘大鼠的干預作用及其機制.pdf

1、背景：支氣管哮喘是一種以可逆性氣流受阻、氣道炎癥和氣道高反應性為特征的疾病,隨著分子生物學、分子遺傳學以及分子免疫學的眾學科在哮喘研究中的不斷發(fā)展,目前證實其發(fā)生發(fā)展牽涉神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等眾多機制。神經(jīng)生長因子(NGF)是一種對神經(jīng)生長、發(fā)育和分化起到重要作用的神經(jīng)肽類,可由腎上腺髓質(zhì)細胞合成并分泌。哮喘究竟是一種全身性疾病還是單獨的氣道性疾病?目前尚無定論。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),支氣管哮喘大鼠存在腎上腺素合成和釋放障礙。神經(jīng)生長因子可

2、能通過啟動哮喘大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞冗余性致腎上腺素釋放障礙而參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展。用NGF抗體經(jīng)14天腹腔給藥,對哮喘大鼠進行干預,在降低體內(nèi)NGF表達的同時可以使氣道炎癥得以緩解。然而將NGF抗體(抗-NGF)成功應用于哮喘患者還存在一些困難:如外源性生長因子及其抗體的生物半衰期短,給藥后使用很快被稀釋和代謝,故需要多次、大劑量給藥；又如抗-NGF全身應用的毒副反應尚不明確,并能拮抗機體內(nèi)源性NGF,降低其正常生理學效應。用何辦法能

3、簡單、有效的抑制腎上腺素減少從而減輕或抑制哮喘發(fā)作?近年來,微球和納米粒子作為藥物運載系統(tǒng)引起越來越多人們的興趣,微球是一種以適宜高分子材料為載體包裹或吸附藥物而制成的球形或類球形的微粒,緩釋微球則是以生物可降解聚合物為載體材料制成的微球,通過微球內(nèi)部的孔道以及高分子材料的融蝕降解來調(diào)控蛋白質(zhì)在體內(nèi)外的釋放。蛋白微球的制備最常用的方法是采用水/油/水(W1/O/W2)的雙乳化技術。在生物可降解聚合物中,聚乳酸(PLA)和聚(乳酸.羥基乙

4、酸)共聚物(PLGA)由于其無毒且能在體內(nèi)緩慢降解的特性而得到廣泛的應用,并且是已經(jīng)被美國FDA批準為可用于人體的載體材料。包載藥物的緩釋微球具有粒徑小(1-250μm)、長周期緩慢釋放藥物、對生物體無毒等優(yōu)點?；诖?本課題以NGF、抗-NGF為包被藥物,采用W1/O/W2的雙乳化-溶劑揮發(fā)技術,成功制備粒徑約μm,釋放15天以上的PLGA微球,并分別將抗-NGF緩釋微球和NGF緩釋微球直接注入哮喘大鼠腎上腺實現(xiàn)局部干預,檢測對肺功能

5、、肺組織結(jié)構(gòu)、血清學指標等影響,探討抗-NGF緩釋微球局部干預對哮喘大鼠的干預作用及其機制,尋找可能的哮喘防治新方法。
　　 第一章、NGF、抗NGF微球的制備及其評價
　　 目的：制備粒徑均勻(15μm左右)能夠持續(xù)釋放神經(jīng)生長因子(抗神經(jīng)生長因子)達15天以上,有良好的體外緩釋效果的NGF-(抗-NGF)PLGA緩釋微球,為后續(xù)實驗以提供干預劑。
　　 方法：運用水/油/水(W1/O/W2)的雙乳化技術,以牛

6、血清白蛋白(BSA)為載體,制備NGF(抗-NGF)-PLGA緩釋微球,進行其外觀、粒徑、載藥量、包封率、體外釋放情況的檢測與評價。
　　 結(jié)果：神經(jīng)生長因子緩釋微球(BSA/PLGA15/100,NGF、抗-NGF/BSA1/2000)表面光滑,形態(tài)圓整,粒徑(15.5±5.2)μm,載藥量8.45％,包封率55.7％。在體外釋放的第3、6、9、12、15天分別有32.14％、44.5％、50.99％、63.51％、79.53

7、％的NGF從PLGA微球中釋放。
　　 結(jié)論：水/油/水(W1/O/W2)的雙乳化技術可以成功制備包載神經(jīng)生長因子的微球,其成球性佳,粒徑均勻(15μm左右),重現(xiàn)性好。蛋白/多聚物比率越高,蛋白包封率則越低,但載藥量也越高。神經(jīng)生長因子緩釋微球能夠持續(xù)釋放神經(jīng)生長因子達15天以上,有良好的體外緩釋效果。
　　 第二章、神經(jīng)生長因子微球局部植入對哮喘大鼠的干預作用及其機制
　　 目的：利用抗-NGF緩釋微球和NG

8、F緩釋微球直接注入哮喘大鼠腎上腺實現(xiàn)局部干預,探討抗NGF對哮喘的治療作用,尋找可能的哮喘治療新方法。
　　 方法：雄性SD大鼠32只,隨機分為正常對照組、哮喘模型組、NGF微球干預組、抗-NGF微球干預組,分別干預各組大鼠。進行大鼠行為學觀察和肺功能檢測、光鏡下觀察肺組織切片、電鏡下觀察腎上腺髓質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)的變化、免疫組織化學檢測腎上腺組織中NGF和苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PNMT)陽性表達、ELISA法檢測血清中NGF、皮

9、質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、腎上腺素、去甲腎上腺素的濃度變化情況。
　　 結(jié)果：大鼠行為學顯示哮喘組大鼠均有不同程度噴嚏、流涕、喘鳴、搔抓頭面部、煩躁鉆洞、大小便失禁、攻擊性增強等行為,抗-NGF組則上述癥狀相對較輕,動物表現(xiàn)較安靜。肺功能檢測提示哮喘組、抗-NGF組、NGF組大鼠均存在明顯的氣道高反應,同時抗NGF組與哮喘組相比,氣道阻力值減低,動態(tài)肺順應性值升高。肺組織切片HE染色顯示:哮喘組大鼠存在明顯支氣管收縮征象及其周圍炎癥細胞浸潤

10、,小血管周圍、肺泡腔、肺間質(zhì)大量炎細胞浸潤,可見支氣管上皮細胞脫落,抗-NGF組支氣管收縮征象不明顯,炎性細胞浸潤現(xiàn)象較哮喘組輕。氣管上皮較完整,腔內(nèi)無明顯炎性分泌物滲出現(xiàn)象。電鏡觀察可見:哮喘組、NGF組腎上腺組髓質(zhì)細胞均出現(xiàn)空泡樣改變,嗜鉻顆粒分布不均勻,數(shù)量和濃度較正常組明顯降低；NGF組腎上腺髓質(zhì)細胞膜似見杵狀和絨毛狀突起；抗NGF組無明顯空泡樣改變,嗜鉻顆粒數(shù)量及濃度均基本接近正常組。圖像分析結(jié)果顯示抗NGF組PNMT和NGF

11、免疫組化結(jié)果平均灰度值分別為(193.39±.95)、(173.78±3.23),與哮喘組比較均有明顯差異(P分別＜0.05、0.01)；ELISA結(jié)果顯示:(1)各組間腎上腺素平均濃度水平依次為對照組＞抗NGF組＞哮喘組＞NGF組；抗NGF組與哮喘組、哮喘組與正常組、NGF組與哮喘組對比均有明顯差異(P均＜0.01)。(2)各組間去甲腎上腺素平均濃度水平依次為NGF組＞哮喘組＞抗NGF組＞對照組；抗NGF組與哮喘組、哮喘組與正常組、N

12、GF組與哮喘組對比均有明顯差異(P均＜0.01)。(3)各組間皮質(zhì)醇濃度水平差異無顯著性(P均＞0.05)。(4)各組皮質(zhì)酮平均濃度水平依次為對照組＞抗NGF組＞哮喘組＞NGF組；抗NGF組與哮喘組、哮喘組與對照組、NGF組與哮喘組對比均有明顯差異(P＜0.01、0.01、0.05)。
　　 結(jié)論：局部植入抗-NGF微球能減輕哮喘大鼠肺組織炎性浸潤、改善肺功能。其作用機制可能為抗-NGF將NGF拮抗后逆轉(zhuǎn)了其啟動腎上腺髓質(zhì)細胞轉(zhuǎn)