神經(jīng)生長因子致哮喘神經(jīng)源性炎癥信號傳導通路研究.pdf

1、支氣管哮喘是由多種免疫炎癥細胞(如肥大細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等)及其細胞組份參與的以反復發(fā)作可逆性氣流受限和氣道高反應性為特征的氣道慢性非特異性炎癥性疾病。目前認為，神經(jīng)源性炎癥是支氣管哮喘發(fā)病的重要機制。最近研究其在NGF所致哮喘神經(jīng)源性炎癥的作用機制有望成為治療哮喘發(fā)病的新靶點。 第一部分：神經(jīng)生長因子調控哮喘大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥的信號傳導通路初探 通過雞卵蛋白(OVA)致敏激發(fā)建立哮喘模型，將SD大鼠隨機分為

2、3組：哮喘組、正常對照組、抗NGF組，每組12只。模型建立后進行以下研究：取肺組織切片HE染色觀察病理改變，以此觀察模型的氣道炎癥程度。取三組大鼠肺組織、背根節(jié)采用免疫組化對pan-Ras、pERK、c-fos蛋白進行定位和定性分析。結果顯示：在肺組織中pan-Ras、pERK、c-fos陽性反應物質均呈棕黃色，主要位于細胞漿中。哮喘組呈強陽性反應，正常對照組呈弱陽性反應。哮喘組pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分別為152

3、.65±15.95、152.89±13.52、130.62±10.46較正常對照組(pan-Ras、pERK、c-fos 平均灰度值分別為 174.74±14.61、179.55±13.83、165.04±11.57)陽性產(chǎn)物的平均灰度值均明顯降低(P<0.01)?？筃GF組大鼠肺組織中免疫反應陽性細胞表達較哮喘組明顯減少，呈弱陽性反應 (pan-Ras、pERK、c-fos 平均灰度值分別為 174.08±14.94、177.80±1

4、5.08 及 165.02±11.33)。背根節(jié)中 pan-Ras、pERK、c-fos陽性反應物質均呈棕黃色，pan-Ras、pERK主要位于細胞漿中，而c-fos 位于細胞漿和細胞核中。正常對照組呈弱陽性反應，哮喘組呈強陽性反應，抗NGF組呈弱陽性反應。哮喘組pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分別為 151.40±15.89、154.84±13.22、137.21±13.05 較正常對照組 171.44±16.43、17

5、5.34±13.24、175.51±7.76明顯降低，P<0.01。抗NGF干預后，pan-Ras、pERK、c-fos 表達減少，其灰度值分別為168.41±17.27、170.78±13.34及163.89±8.92，較哮喘組有統(tǒng)計學差異，P<0.05。 第二部分：人支氣管上皮細胞NGF信號傳導通路初探 我們選用參與哮喘神經(jīng)源性炎癥的重要效應細胞一正常人支氣管氣道上皮細胞株(NHBEC)作為研究對象。NHBEC于含1

6、0％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實驗分8組：(1)A組：正常對照組；(2)B組：NGF組；(3)C組：NGF+PD98059組；(4)D組：PD98059組；(5)E組：NGF+PMA組；(6)F組：PMA組；(7)G組：NGF+AG490組(8)H組：AG490組。并分別進行細胞干預。干預后免疫印跡法半定量測定細胞 c-fos、p-ERK及total-ERK 蛋白含量。RT-PCR方法半定量檢測各組細胞NK-1R mRNA含量。并

7、應用免疫細胞化學定性觀察各組細胞表達NK-1R的情況。結果顯示：與正常對照組相比，c-fos 蛋白及磷酸化的ERK1/2蛋白水平在NFG作用30min時，顯著增高并達到峰值；而total-ERK蛋白水平則不受NGF影響；在NGF未處理的PD98059組及AG490組c-fos蛋白水平、磷酸化的ERK1/2蛋白水平幾乎檢測不到；而在NGF組，經(jīng)NGF作用30min后，可見c-fos蛋白水平及磷酸化的ERK1/2蛋白水平顯著增高，c-fos

8、/GAPDH及pERK/GAPDH光密度比值分別為0.8354±0.1012、1.3187±0.2078，與正常對照組相比P<0.01。PD98059可明顯抑制NGF誘導NHBEC表達c-fos蛋白及磷酸化的ERK1/2蛋白，c-fos/GAPDH及pERK/GAPDH光密度比值分別為0.3012±0.1034、0.3146±0.0957，與NGF組相比P<0.01。PMA可刺激NGF誘導NHBEC表達c-fos及磷酸化的ERK1/2蛋

9、白。而STAT3傳導途徑特異性抑制劑AG490則無此作用。免疫細胞化學研究結果顯示：正常對照組及PD98059組NK-1R表達呈陰性反應；NGF組及NGF+PMA組呈強陽性反應；PMA組呈陽性反應；而NGF+PD98059組呈弱陽性反應。RT-PCR結果顯示：與正常對照組相比，NK-1RmRNA在NGF未處理的PD98059組表達較少；而在NGF組，經(jīng)NGF作用1h后，可見NK-1RmRNA水平顯著增高(光密度比值1.0682±0.15

10、97)，與正常對照組(光密度比值0.3753±0.0642)相比P<0.01。PD98059可抑制NGF誘導NHBEC表達NK-1RmRNA(光密度比值0.4787±0.0981)。PMA可刺激NGF誘導NHBEC表達NK-1RmRNA。 第三部分：c-fos RNAi技術對NGF Ras-MAPK 信號通路的影響 培養(yǎng)NHBEC，設計 c-fos siRNA，通過陽離子脂質體轉染至細胞內，再進行NGF干預。實驗分(1)

11、A組：正常對照組；(2)B組：NGF組；(3)C組：NGF+dsRNA nonspecific組；(4)D組：NGF+FOS1組；(5)E組： NGF+FOS2組；(6)F組：NGF+FOS3組；(7)G組：NGF+空白載體組。細胞干預后分別提取總蛋白免疫印跡半定量測定各組c-fos蛋白表達；提取總RNA RT-PCR半定量檢測NK-1R mRNA，并應用免疫細胞化學法定性檢測各組NK-1R表達。結果顯示：經(jīng)NGF刺激后，c-f

12、os蛋白表達較正常對照組明顯增加，c-fos/GAPDH 吸光度比值為1.1861±0.1427，較正常對照組(吸光度比值0.3122±0.0914)，P<0.01；c-fos shRNA可抑制NGF誘導NHBEC 表達c-fos 蛋白，c-fos/GAPDH 吸光度比值分別為1.0965±0.2591、0.6574±0.1373、0.3773±0.136；與NGF組比較，P<0.01；無關shRNA，空質粒均無此作用。與正常對照組相比

13、，NHBEC經(jīng)NGF作用1h后，可見NK-1RmRNA水平顯著增高，NK-1RmRNA/beta-actin吸光度比值為1.0047±0.1106，與對照組(NK-1 RmRNA/beta-actin 吸光度比值為0.413±0.0473)比較，P<0.01。FOS3可抑制NGF誘導NHBEC表達NK-1R mRNA，其NK-1RmRNA/beta-actin 吸光度比值為0.6214±0.0971與NGF組相比P<0.01。無關shR

14、NA，空質粒均無此作用。免疫細胞化學結果顯示NK-1R陽性產(chǎn)物為棕黃色，以NHBEC胞漿著色為主。正常對照組NK-1R表達呈陰性反應；NGF組及NGF+HK siRNA組呈強陽性反應；NGF+無關siRNA組呈陽性反應；而NGF+siRNA組呈弱陽性反應。 上述三個部分研究提示NGF通過調控神經(jīng)源性炎癥介質SP參與哮喘神經(jīng)源性炎癥機制，其信號通路可能是Ras-MAPK途徑。阻斷Ras-MAPK信號傳導通路，有望成為治療哮喘的新途