125I-血管抑素受體內(nèi)化作用及其影響因素的研究.pdf

1、血管抑素（Angiostatin，AS）是O’Reilly等于1994年從Lewis肺癌小鼠血清和尿液中分離出的能夠特異性抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的因子。AS是大分子物質(zhì)纖溶酶原的一個(gè)片段，相對(duì)分子量為38KD。自從發(fā)現(xiàn)AS能強(qiáng)烈抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管的新生,其生物學(xué)效應(yīng)和作用方式即引起了人們極大的關(guān)注。AS作用機(jī)制不十分明了，內(nèi)化可謂一個(gè)熱點(diǎn)，人們公認(rèn)的受體大致為αⅤβ3、ATP合成酶及Angiomotin等。本研究以125I標(biāo)記

2、的AS為放射性配基，探討ECV304細(xì)胞內(nèi)化AS的能力以及125I-AS殺傷ECV304細(xì)胞的劑量效應(yīng)關(guān)系，并探討溫度、時(shí)間及125I-AS濃度等因素對(duì)ECV304細(xì)胞內(nèi)化AS的影響，為125I-AS作為AS受體陽性腫瘤的放射治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　利用125I標(biāo)記AS，研究標(biāo)記產(chǎn)物125I-AS的體外穩(wěn)定性及生物活性，探討人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304細(xì)胞內(nèi)化AS的能力及125I-AS殺傷ECV304細(xì)胞的

3、效應(yīng)，并探討溫度、時(shí)間及125I-AS濃度等因素對(duì)ECV304細(xì)胞AS受體內(nèi)化的影響。
　　方法：
　　1、利用彈性蛋白酶有限水解法制備AS，水解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定后，用Ch-T法進(jìn)行標(biāo)記，用紙層析法測(cè)標(biāo)記率。
　　2、用Sephadex-G50柱對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物分別加入牛血清白蛋白(BSA)、生理鹽水及不同摩爾比的半胱氨酸（Cys）以觀察其體外穩(wěn)定性。并利用細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)記純化產(chǎn)物

4、的生物活性。
　　3、采用放射性配基結(jié)合分析法，以125I-AS為放射性配基，37℃條件下，AS受體陽性細(xì)胞ECV304與125I-AS共同保溫不同時(shí)間后，分別檢測(cè)細(xì)胞的受體內(nèi)化率；采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)不同劑量125I-AS、游離125I及AS對(duì)ECV304細(xì)胞作用24，48，72，96h的殺傷作用。
　　4、于4℃、24℃及37℃條件下，固定濃度125I-AS與ECV304細(xì)胞共同保溫不同時(shí)間后，分別檢測(cè)細(xì)胞

5、的受體內(nèi)化率。
　　5、37℃條件下，不同濃度125I-AS與ECV304細(xì)胞共同保溫不同時(shí)間后，分別檢測(cè)細(xì)胞的受體內(nèi)化率。
　　結(jié)果：
　　1、蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，相對(duì)分子量為38KD，125I-AS標(biāo)記率可達(dá)85％。
　　2、125I-AS在生理鹽水中1、4、24h的解離率分別為2.3％、5.2％、8.0％，在10g/L BSA中1、4、24h的解離率分別為4.6％、9.1％、11.0

6、％。在不同摩爾比Cys溶液中孵育，125I-AS存在不同程度的解離，摩爾比在5以下時(shí)，4h的解離率不超過11％，表明標(biāo)記產(chǎn)物在體外較穩(wěn)定。分別用不同濃度125I-AS和AS作用于ECV304細(xì)胞，并以6-氨基己酸作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)125I-AS及AS對(duì)ECV304細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，且125I-AS的作用強(qiáng)于單純的AS，表明125I-AS具有較強(qiáng)的生物活性。
　　3、37℃條件下溫育，125I-AS與AS受體結(jié)合并迅速使受體發(fā)

7、生內(nèi)化。0.5h內(nèi)，受體內(nèi)化率、膜受體結(jié)合率及細(xì)胞總結(jié)合率均隨時(shí)間的延長而增加，在0.5h時(shí)，受體內(nèi)化率為(12.6±1.1)％，膜受體結(jié)合率為（19.1±2.2）％，細(xì)胞總結(jié)合率為(31.7±1.6)％（r=0.814, P<0.05）。0.5h后，受體內(nèi)化率隨時(shí)間的延長繼續(xù)增加，膜受體結(jié)合率隨時(shí)間的延長逐漸減少，至24h時(shí)，受體內(nèi)化率達(dá)(28.0±3.0)％，膜受體結(jié)合率為（10.8±1.4）％，細(xì)胞總結(jié)合率為(38.8±2.3)％

8、（r=-0.681, P<0.05）。125I-AS對(duì)ECV304細(xì)胞殺傷作用呈劑量-效應(yīng)、時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。以370 KBq/ml125I-AS作用96h的殺傷效應(yīng)最大，明顯強(qiáng)于Na125I或AS對(duì)ECV304細(xì)胞的抑制效應(yīng),細(xì)胞抑制率達(dá)（79.4±3.7）％(F=312.9013，P<0.01)。
　　4、4℃時(shí)，受體內(nèi)化率較低，24℃時(shí)，受體內(nèi)化率有所增加，37℃時(shí)，受體內(nèi)化率較高；37℃時(shí)，隨125I-AS濃度增大，受體內(nèi)化

9、率降低；不同溫度、濃度時(shí)，受體內(nèi)化率均隨時(shí)間延長而增加。
　　結(jié)論：
　　用Ch-T法進(jìn)行125I-AS標(biāo)記簡單易行，125I-AS對(duì)ECV304細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，有較強(qiáng)的生物活性，標(biāo)記產(chǎn)物在體外較穩(wěn)定。125I-AS可在AS受體介導(dǎo)下內(nèi)化進(jìn)入并殺傷ECV304細(xì)胞，呈劑量-效應(yīng)、時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。ECV304細(xì)胞AS受體內(nèi)化受溫度、時(shí)間及125I-AS濃度等因素影響，呈溫度-效應(yīng)、時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，隨125I-AS濃度