α-Gal抗原模擬表位分析及模擬肽活性鑒定.pdf

1、阻斷人天然抗α-Gal抗體與豬細(xì)胞表面大量表達(dá)的α-Gal抗原是異種器官移植成功的一個(gè)重要前提。在異種器官移植中，這些α-Gal抗原可與人天然抗α-Gal抗體誘發(fā)超急排斥反應(yīng)。為找到能夠運(yùn)用于異種器官移植中的特異性結(jié)合抗體的多肽，對(duì)兩種肽庫進(jìn)行了親和篩選：線性7肽庫和C7C肽庫。采用抗B型血單克隆抗體為靶分子，經(jīng)過4輪篩選，隨機(jī)挑取了160個(gè)噬菌體克隆，經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)22個(gè)克隆特異地結(jié)合抗體。DNA測序結(jié)果顯示，這些篩選出來的多肽

2、具有高度同源序列PT和STL。水蘇糖競爭實(shí)驗(yàn)證明這些多肽都特異性地結(jié)合于α-Gal抗原表位結(jié)合位點(diǎn)。血凝實(shí)驗(yàn)表明8個(gè)多肽可以競爭性抑制由人天然抗α-Gal抗體誘發(fā)的凝血反應(yīng)。這些結(jié)果說明篩選出來的多肽能夠在空間構(gòu)象上模擬α-Gal抗原表位。這些α-Gal抗原表位模擬肽所提供的分子結(jié)構(gòu)信息為將來進(jìn)一步開發(fā)抗異種器官移植超急排斥反應(yīng)的藥物提供了基礎(chǔ)。 1噬菌體展示肽庫的篩選以抗B型血單克隆抗體包被酶標(biāo)板，5％牛血清白蛋白37℃封閉2

3、小時(shí)，TBS洗板3次，加入噬菌體肽庫室溫反應(yīng)1小時(shí)，含0.1％Tween-20的TBS洗板10次，每孔加入酸洗脫液洗脫10分鐘，然后用中和液中和。將洗脫的噬菌體感染感受態(tài)E.coliER2738擴(kuò)增，純化，進(jìn)行下一輪的篩選。噬菌體線性7肽庫和C7C肽庫經(jīng)過4輪篩選，各出現(xiàn)不同程度的富集現(xiàn)象。 2酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)篩選陽性噬菌體第4輪洗脫下來的噬菌體感染E.coliER2738，從平板中隨機(jī)挑取了160個(gè)噬菌斑，制備單克隆噬菌體溶液

4、。在酶標(biāo)板中包被抗B型血單克隆抗體，加入單克隆噬菌體溶液(2×1012TU)反應(yīng)1小時(shí)，含0.1％Tween20的TBS洗板6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗M13抗體，結(jié)合1小時(shí)，用含0.1％Tween20的TBS洗板6次，加入TMB進(jìn)行顯色，通過ELISA實(shí)驗(yàn)比較它們與抗體和BSA的不同結(jié)合反應(yīng)，篩選特異性結(jié)合抗體而非BSA的陽性克隆。我們從線性7肽庫中篩選出了16個(gè)陽性克隆，而從C7C肽庫中只篩選出6個(gè)陽性克隆。 3DNA測序

5、對(duì)篩選得到的陽性噬菌體提取單鏈DNA，送上海生工進(jìn)行測序，引物為5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。根據(jù)噬菌體單鏈DNA的測序結(jié)果，我們推測出篩選的陽性噬菌體表面展示的多肽氨基酸序列。線性七肽與環(huán)肽之間存在共同的保守序列PT。 4水蘇糖競爭性ELISA實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)板中包被抗B型血單克隆抗體，加入陽性噬菌體和不同濃度的水蘇糖混合反應(yīng)1小時(shí)，另設(shè)不加水蘇糖的陽性噬菌體液作為空白對(duì)照。用含0.1％Tween20的TBS

6、洗板6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗M13抗體，結(jié)合1小時(shí)，用含0.1％Tween20的TBS洗板6次，TMB進(jìn)行顯色，用酶標(biāo)儀測定吸光度。計(jì)算抑制率按照公式：[A450(-s)-A450(+s)]/A450(-s)×100％，A450(-s)為未加水蘇糖的吸光度，A450(+s)為加入水蘇糖的吸光度。水蘇糖具有和α-Gal抗原極其相似的分子結(jié)構(gòu)，能特異性地結(jié)合于α-Gal抗原表位結(jié)合位點(diǎn)，因此我們進(jìn)一步通過水蘇糖競爭性抑制試驗(yàn)來檢驗(yàn)篩選

7、的多肽與抗α-Gal抗體的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示水蘇糖能有效的抑制多肽與抗體的結(jié)合，說明水蘇糖與多肽結(jié)合于抗體的同一位置，即α-Gal抗原表位結(jié)合位點(diǎn)。 5DTT還原實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)板中包被抗B型血單克隆抗體。將DTT加入噬菌體溶液中，至終濃度為2mM，反應(yīng)1小時(shí)。將未加DTT的噬菌體溶液作為對(duì)照。ELISA檢驗(yàn)OD450的變化。二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑打開二硫鍵，使多肽有環(huán)狀變?yōu)榫€性。通過ELISA我們比較了使用DTT前后多肽與抗

8、體結(jié)合情況的變化。對(duì)于線性7肽庫中展示的多肽，加入DTT前后多肽與抗體的親和力沒有明顯的變化。而當(dāng)C7C肽庫中展示的多肽的二硫鍵被打開時(shí)，其親和力有不同程度的下降，表明對(duì)于從C7C肽庫中篩選的多肽，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)它們形成適宜構(gòu)象與抗體有效結(jié)合是必需的。 6多肽的合成根據(jù)由測定的DNA推導(dǎo)出來的多肽序列，由杭州中肽生化有限公司采用固相法合成。純度經(jīng)HPLC檢驗(yàn)達(dá)到70％以上，分子量經(jīng)質(zhì)譜測定符合理論大小。 7陽性噬菌體和多肽

9、對(duì)豬紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)將豬紅細(xì)胞用PBS洗滌3次后，重懸于PBS中，其終濃度為1％。將1％豬紅細(xì)胞與PBS稀釋的1％人血清在血凝板混合上，再分別加入不同濃度的陽性噬菌體和多肽溶液混勻，室溫靜置1小時(shí)后觀察結(jié)果。如果紅細(xì)胞沉淀到孔底，呈一邊緣光滑的圓點(diǎn)，則為沒有凝集；如果紅細(xì)胞形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，沒有下沉到孔底，則為凝集。凝血實(shí)驗(yàn)表明8個(gè)克隆展示的多肽可有效抑制由人天然抗α-Gal抗體誘發(fā)的凝血反應(yīng)。 為了尋找應(yīng)用于異種器官移植中的多肽