霍亂毒素B亞單位與糖尿病自身抗原表位肽融合基因的克隆、表達及鑒定.pdf

1、通過口服自身抗原誘導免疫耐受能夠延遲和抑止自身免疫型疾病和過敏反應，但是口服誘導免疫耐受需要大劑量的抗原或者長期給予小劑量的抗原，而且只有在一個相當窄的范圍內(nèi)有效，免疫致敏個體中免疫耐受難于誘導?；魜y毒素B亞單位分子(choleratoxinB,CTB)能夠克服上述缺點。CTB作為一種載體蛋白分子與糖尿病自身抗原胰島素B(InsulinB，InsB)鏈分子交聯(lián)后口服NOD(non-obesediabetic)小鼠，能夠顯著減輕胰島炎癥程

2、度和Ⅰ型糖尿病的發(fā)生率，而且所需的胰島素劑量只有單純使用胰島素的1/500-1/5000，但是化學交聯(lián)蛋白成份復雜，難于純化，而基因工程融合蛋白分子較化學交聯(lián)蛋白分子有明顯的優(yōu)越性，融合蛋白分子具有操作簡便，組分單一等特點。 本實驗通過重疊PCR技術分別將胰島素B鏈基因和谷氨酸脫羧酶(Glutamateaciddecarboxylase，GAD)(531-545)肽段基因分別融合到CTB基因的3'端，獲得融合基因CTB-InsB

3、(CI)，CTB-GAD(CG)。將CI、CG基因酶切后克隆到pET22b載體上，轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。經(jīng)FML培養(yǎng)基中的乳糖誘導重組質粒表達目的蛋白。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后表明該菌株可以表達目的蛋白，CG的分子量為14KD，CI的分子量為17KD，表達產(chǎn)物以包涵體形式表達。CG的表達量占全菌蛋白的30﹪左右，CI的表達量占全菌蛋白的35﹪左右。超聲破菌后獲得包涵體，經(jīng)2M尿素溶液洗滌后，溶于8M的尿素溶液中，