蝦類過敏原的活性分析及其抗原表位的研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展,人們飲食結(jié)構(gòu)的變化,與食物直接相關(guān)的過敏疾病發(fā)病率日益增高,給人們的生命健康造成了巨大威脅。蝦類產(chǎn)品屬于我國產(chǎn)值比較高的甲殼類海產(chǎn)品,由于味道鮮美、營養(yǎng)豐富,深受消費者的喜愛。然而蝦類海產(chǎn)品屬于8大類食物過敏原之一,使許多消費者飽受過敏癥狀的困擾。本論文著重對蝦類過敏原的鑒定和活性消除方法進行研究,結(jié)合生物信息學(xué)方法進一步分析過敏原的表位區(qū)域及氨基酸組成性質(zhì),并對表位進行空間定位。主要內(nèi)容如下:
　　 1、以

2、刀額新對蝦為研究對象,分離和純化了分子量為36kD的主要過敏原蛋白,利用基質(zhì)輔助激光解析電離/飛行時間質(zhì)譜對其進行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定,并對得到的結(jié)果采用Mascot搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫上進行搜索。結(jié)果表明刀額新對蝦主要過敏原為原肌球蛋白,與斑節(jié)對蝦原肌球蛋白匹配分值最高為268,吻合肽段27條,序列覆蓋率為65％;與其它無脊椎動物如腐食酪螨、衣魚等的原肌球蛋白的序列覆蓋率也很高。這一結(jié)果不僅表明了刀額新對蝦與其它甲殼類海產(chǎn)品過敏

3、原存在著高度同源性,而且為其與甲殼類及其它無脊椎動物主要過敏原之間存在嚴重交叉反應(yīng)的現(xiàn)象提供了理論依據(jù)。
　　 2、在鑒定了刀額新對蝦的主要過敏原之后,進一步分析了常見熱加工方式對其過敏原活性的影響。選取煮、蒸、高壓這三種方法,分別處理刀額新對蝦不同時間。通過檢測總蛋白和主要過敏原含量以及活性的變化,分析對蝦類過敏原的影響。結(jié)果表明經(jīng)過三種熱處理后,36kD主要過敏原蛋白仍然存在,但其活性有不同程度的下降。在25-35kD區(qū)域出

4、現(xiàn)一條新的免疫活性蛋白,但影響不大,全蛋白的免疫活性仍有不同程度的降低。其中高壓對活性的降低程度最大,30分鐘時免疫活性降低了97％。但質(zhì)地剖面分析結(jié)果表明,高壓處理對蝦肉質(zhì)構(gòu)破壞最大,仍需進一步優(yōu)化高壓處理工藝,在降低蝦致敏活性的同時,保持其口感及營養(yǎng)。
　　 3、利用生物信息學(xué)方法對蝦過敏原及其他甲殼類過敏原之間的同源性進行分析,并繪制出系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明甲殼類過敏原原肌球蛋白氨基酸序列十分保守,序列之間同源性很高。其中斑

5、節(jié)對蝦、凡納濱對蝦過敏原同褐美對蝦主要過敏原Pen a1的氨基酸序列完全相同。
　　 采用DNAstar、AntheProt等生物信息學(xué)軟件分析Pen a1的二級結(jié)構(gòu)、親水性、溶劑可及性、可塑性、抗原指數(shù)等多個性質(zhì),間接預(yù)測線性表位區(qū)域,并結(jié)合2個在線網(wǎng)站對表位的預(yù)測結(jié)果進行篩選,得到10個抗原表位后進行表位肽的固相合成。采用競爭Dot-blot方法,利用患者血清對表位肽的活性進行初步驗證。結(jié)果表明其中8個表位多肽為主要過敏原表

6、位,其中有兩個以前未曾有研究者報道過。對表位區(qū)域的氨基酸分析中發(fā)現(xiàn)精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、絲氨酸(S)以及谷氨酸(E)這5種氨基酸在表位區(qū)域出現(xiàn)概率很高。
　　 4、以豬原肌球蛋白1c1gC為模板,利用SWISS-MODEL以及CPHmodels中相關(guān)的同源建模功能對Pen a1的空間結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。采用原子平均勢能、分子體系動力學(xué)分析以及拉氏構(gòu)象圖對建模結(jié)果進行評估。結(jié)果表明模擬形成的Pen a1構(gòu)象有較高的

7、穩(wěn)定性和合理性。從構(gòu)象中可以看出,Pen a1空間結(jié)構(gòu)比較簡單,沒有復(fù)雜的三、四級結(jié)構(gòu),二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主。從構(gòu)象方面分析,Pen a1單鏈自身形成構(gòu)象型表位的幾率不大,而線性表位在空間中的定位結(jié)果也顯示基本上線性表位全部暴露在外。
　　 5、利用氨基酸突變的方法研究Pen a1表位中的關(guān)鍵氨基酸,選擇Pen a1中peptide6和peptide10這兩條表位肽,將其中的活性氨基酸替代為人或豬原肌球蛋白中相應(yīng)的非活性氨