華支睪吸蟲模擬抗原表位的篩選和鑒定.pdf

1、目的:應用噬菌體展示隨機12肽庫技術篩選可以與華支睪吸蟲病人混合血清特異性結合的華支睪吸蟲模擬抗原表位，分析其序列、結構特點及免疫活性，探討應用華支睪吸蟲模擬抗原表位檢測華支睪吸蟲病人血清的可行性。 方法:(1)用飽和硫酸銨鹽析法提取華支睪吸蟲病人混合血清IgG，Lawry 法測定蛋白濃度，SDS-PAGE鑒定IgG的純度，斑點免疫金銀染色(dot-IGSS)檢測純化IgG的活性。(2)用純化IgG對噬菌體展示隨機12肽庫進行3

2、輪親和篩選。(3)ELISA法檢測第三輪篩選后隨機挑選的噬菌體單克隆的免疫活性并予以擴增。(4)依ELISA的檢測結果挑選免疫活性較高的克隆進行序列分析及免疫學鑒定。(5)Western blot檢測各陽性噬菌體單克隆展示的表位類型。 結果:(1)經(jīng)過純化后收集到免疫球蛋白，Lowry法測定其濃度為5.3mg/ml，SDS-PAGE電泳未見雜帶，達到電泳純，純化IgG與華支睪吸蟲成蟲抗原斑點免疫金銀染色反應結果為強陽性。(2)經(jīng)

3、3輪篩選，噬菌體的回收率逐輪上升，說明篩選中所獲得的噬菌體克隆有較高程度的富集。(3)隨機挑選的20個單個噬菌斑的擴增液，ELISA檢測其中12個為陽性，從中挑取6個免疫活性較高的克隆(P1～P6)進行的DNA序列分析，得到6個DNA序列。(4)斑點免疫金銀染色檢測6個克隆有3個可被華支睪吸蟲病人血清識別(P1～P3)。(5)用ELISA法對華支睪吸蟲模擬抗原表位和華支睪吸蟲成蟲抗原(CsA)進行比較實驗，顯示這6個模擬抗原表位特異性及