細小病毒H-1-重組細小病毒對胃癌細胞的作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:觀察細小病毒H-1感染后對胃癌細胞凋亡及核修復相關基因表達的影響,試從分子水平探討其對胃癌細胞毒作用的相關機制。構建和鑒定表達人IL-2/P27/P21蛋白的重組細小病毒H-1,了解該表達載體對胃癌細胞株HGC27的作用,為進一步研究IL-2/p27/p21的生物學作用以及利用細小病毒載體進行腫瘤基因治療奠定基礎。 方法:選取人胃癌細胞株HGC27和BGC823,運用基因芯片技術分析HGC27細胞基因表達譜的改變,用RT-

2、PCR和實時定量PCR分別對部分凋亡和核修復相關基因的表達作進一步驗證,并比較BGC823細胞中相應基因的表達差異。采用RT-PCR技術克隆p27/p21cDNA片斷并插入質粒PHl-△800中構成重組載體質粒,經雙酶切篩選鑒定陽性克隆,通過重組載體質粒(PHl-△800/IL-2,PHl-△800/p27和NPHl-△800/p21)與輔助質粒pBK38VP共轉染T293細胞,獲得含有外源性治療基因的重組細小病毒(rhHlA/IL-2

3、,rhHiA/p27,rhHl△/p21),并進一步轉染人胃癌細胞株HGC27,觀察細胞形態(tài)學改變,Westem Blot鑒定其轉移基因的蛋白質表達,RT-PCR檢測轉移基因表達,MTT法檢測其對HGC27細胞生長的抑制作用,流式細胞分析其對細胞增殖周期的影響。 結果:基因芯片結果顯示15對凋亡相關基因表達下調,僅l對上調;12對核修復相關基因表達下調,6對上調。RT-PCR結果示HGC27細胞的SARPl、BCL-10、CL

4、-20和NCDRP表達下調,RAIDD無改變;BGC823細胞的BCL-10和NCDRP表達上調,CL-20和RAIDD無改變,SARPl不表達。定量PCR結果示HGC27細胞中BTG2表達下調,MBD2上調,XRCC4和H2AZ無改變;BGC823細胞中BTG2表達下調,XRCC4,H2AZ和MBD2無改變。重組載體質粒PHl-△800/p27和PHI-△800/p21酶切后篩選得到陽性克隆片段,基因序列經測序無突變。將重組細小病毒轉

5、染人胃癌細胞株HGC27后,經Western Blot及RT-PCR檢測鑒定均表明已成功轉入胃癌HGC27細胞內,并過表達外源性治療基因蛋白IL-2/P27/P21,并使細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,細胞周期比例改變,細胞周期停滯,從而抑制胃癌細胞增殖。 結論:細小病毒H-1可能通過改變一些凋亡或核修復相關基因的表達,進而調節(jié)細胞基因轉錄或周期進展來誘導胃癌細胞死亡。本研究成功構建了感染性重組細小病毒H-1,可在胃癌細胞內過表達所攜帶

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