瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞電離輻射效應(yīng)及誘導(dǎo)細(xì)胞早期衰老相關(guān)基因表達(dá)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　瘢痕疙瘩是遺傳易感性患者皮膚損傷后組織異常修復(fù)的結(jié)果，僅見于人類，亞洲人群多發(fā)，無合適動物模型。對各種治療抵抗，復(fù)發(fā)率高，是目前皮膚科和整形美容外科的治療難點(diǎn)之一。瘢痕疙瘩手術(shù)切除后早期結(jié)合電離輻射較其它治療方案更為有效，且復(fù)發(fā)率和電離輻射總劑量顯著相關(guān)。瘢痕疙瘩組織內(nèi)最主要的功能細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的異常增殖、分泌過多細(xì)胞外基質(zhì)的特征性生物學(xué)行為，是瘢痕疙瘩形成過程中的重要因素，存在與腫瘤細(xì)胞相似的表觀遺傳學(xué)改

2、變。本文擬通過瘢痕疙瘩與正常人皮膚及培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞比較，闡明瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展過程中，是否存在多個(gè)基因及其相關(guān)途徑的相互作用？部分基因是否存在表觀遺傳學(xué)相關(guān)改變，影響其表達(dá)，繼而出現(xiàn)增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝功能改變？不同劑量電離輻射是否部分針對這些環(huán)節(jié)，逆轉(zhuǎn)相應(yīng)基因表達(dá)，在電離輻射后不同階段誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、衰老或其他表現(xiàn)型，繼而產(chǎn)生治療作用。本研究在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，探討不同劑量和時(shí)間電離輻射治療瘢痕疙瘩的相關(guān)機(jī)制，

3、為瘢痕疙瘩診療提供新的思路、治療靶點(diǎn)和潛在治療方案。
　　研究方法和材料：
　　1、不同臨床分期瘢痕疙瘩患者入組，簽署知情同意書，判斷瘢痕疙瘩嚴(yán)重程度，作分類積分及所處階段評價(jià)，建立瘢痕疙瘩患者和相匹配正常人皮膚的原代成纖維細(xì)胞株，并經(jīng)成纖維細(xì)胞鑒定，MTT/CCK-8比色法繪制生長曲線，分析其增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，通過測定兩種原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中羥脯氨酸含量明確膠原產(chǎn)生區(qū)別。
　　2、瘢痕疙瘩及其成纖

4、維細(xì)胞p16基因啟動子區(qū)功能失常的表觀遺傳學(xué)研究，分析其與瘢痕疙瘩嚴(yán)重程度及臨床分期的相關(guān)性。取瘢痕疙瘩皮損及培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞行亞硫酸氫鹽修飾后測序（BSP法），檢測p16基因甲基化狀態(tài)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR判斷兩種原代成纖維細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)、p16、p21、p27基因表達(dá)區(qū)別。并用免疫組化方法檢測皮損組織中p16、p21、p27、p53等細(xì)胞周期激酶抑制劑表達(dá)情況。比較瘢痕疙瘩皮損組織和正常皮膚及成纖維細(xì)胞源性腫瘤

5、-纖維肉瘤的病理區(qū)別，通過增殖細(xì)胞核抗原Ki-67免疫組化染色檢測瘢痕疙瘩和纖維肉瘤的增殖差異。
　　3、電離輻射誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞過早衰老及其相關(guān)基因表達(dá)改變:通過不同劑量(0、2、4、6、8Gy)、電離輻射后不同時(shí)間(3、6、12、24、48、72、96 h)的作用，采用MTT/CCK-8比色法、臺盼藍(lán)染色分析、流式細(xì)胞儀檢測輻照前后細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞增殖和存活能力變化;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測p16、p21、p2

6、7、DNMTs、I型前膠原mRNA變化;Westemblot法檢測這些基因蛋白質(zhì)水平改變，通過測定培養(yǎng)基上清液中羥脯氨酸含量明確電離輻射前后膠原總體水平變化;同時(shí)應(yīng)用p-半乳糖苷酶染色檢測貼壁瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞衰老。根據(jù)增殖抑制情況，p16、p21、p27和I型前膠原基因表達(dá)，及與細(xì)胞周期分布的相關(guān)性，判斷抑制效應(yīng)最為顯著的電離輻射劑量和時(shí)間。
　　研究結(jié)果
　　1、瘢痕疙瘩患者入組12例，患者組和對照組在性別及年齡構(gòu)成比上

7、無顯著性差異。原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KFb)8例，正常人皮膚原代成纖維細(xì)胞(NFb)6例;在細(xì)胞學(xué)水平，KFb細(xì)胞雖然形態(tài)和NFb細(xì)胞相似，但KFb細(xì)胞增殖與膠原產(chǎn)生能力明顯高于NFb細(xì)胞，與NFb相比，KFb處于G2/M期的比例顯著增高，而G0/G1期比例則明顯低于NFb。
　　2、瘢痕疙瘩皮損及其成纖維細(xì)胞中p16基因啟動子區(qū)存在甲基化狀態(tài)，與正常皮膚細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞均存在差異。KFb細(xì)胞中三種DNMTs基因和NFb細(xì)胞相

8、比均存在高表達(dá)，細(xì)胞和組織中細(xì)胞周期相關(guān)基因p16、p21、p27低表達(dá)，組織中P53蛋白高表達(dá)。瘢痕疙瘩皮損真皮處部分Ki-67表達(dá)陽性率高于正常皮膚，遠(yuǎn)低于成纖維細(xì)胞源性腫瘤，纖維肉瘤，且不具備其異型性，膠原含量、核漿比、核分裂像等都有差異。
　　3、電離輻射抑制兩種成纖維細(xì)胞增殖，存在劑量和時(shí)間依賴模式，與NFb細(xì)胞相比，KFb細(xì)胞增殖抑制率更高。輻照后KFb細(xì)胞G0/G1期比例逐漸增高，出現(xiàn)G1期阻滯。4Gy電離輻射后72

9、小時(shí)，衰老特異的β-半乳糖苷酶陽性，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞呈衰老表現(xiàn)型，隨時(shí)間延長，衰老細(xì)胞陽性比例增多。KFb細(xì)胞膠原產(chǎn)生能力降低。細(xì)胞周期相關(guān)基因p16、p21、p27 mRNA和蛋白水平明顯升高，分別在24小時(shí)和48小時(shí)表達(dá)出現(xiàn)高峰。輻照后KFb細(xì)胞DNMTs基因表達(dá)降低。
　　結(jié)論
　　瘢痕疙瘩中存在DNA甲基化狀態(tài)改變，通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，影響成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。研究提示瘢痕疙瘩中存在多個(gè)基因的相互