苦參堿對(duì)缺血性神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其抑制NF-κB信號(hào)的機(jī)制.pdf

1、目的:研究苦參堿(Matrine)對(duì)缺血性神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其抑制NF-kB信號(hào)的機(jī)制。
　　 方法:采用大鼠永久性大腦中動(dòng)脈阻塞(permanent middle cerebral arteryocclusion，pMCAO)方法，建立腦缺血的大鼠模型。采用原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)方法，建立腦缺血的細(xì)胞模型。免疫熒光法和LDH法分別檢測(cè)OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元

2、MAP2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和乳酸脫氫酶漏出率；Hoechst33258染色觀察Matrine對(duì)缺血神經(jīng)元凋亡的影響。Western Blot方法檢測(cè)Matrine對(duì)缺血區(qū)NF-kB信號(hào)通路相關(guān)蛋白IkBa，NF-kB p65表達(dá)的影響。免疫熒光雙標(biāo)記法分析MAP2陽(yáng)性神經(jīng)元NF-kB的核轉(zhuǎn)位。Real Time PCR測(cè)定OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元p53和c-Myc mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:LDH結(jié)果顯示Matrine(50-200 la

3、M)能劑量依賴性地降低神經(jīng)元OGD12h后LDH的漏出率(P<0.01)。免疫熒光法結(jié)果顯示OGD12h模型組MAP2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常組明顯減少(P<0.01)，Matrine可明顯增加MAP2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P<0.05，P<0.01)。Hoechst33258染色結(jié)果顯示OGD12h凋亡細(xì)胞明顯增多(P<0.01)，Matrine可明顯減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05，P<0.01)。Western Blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，在

4、大腦中動(dòng)脈阻塞3h，6h,12h，24h后，缺血區(qū)IkBα的表達(dá)水平在3h開(kāi)始下降，12h達(dá)到最低，24h又開(kāi)始上升；而細(xì)胞核NF-kB p65的表達(dá)水平在3h開(kāi)始上升，12h達(dá)到峰值，24h又開(kāi)始下降。靜脈注射Matrine后，Matrine(12.5-50mg/kg)組明顯升高了缺血區(qū)IkBα的表達(dá)水平，而降低了NF-kB p65的表達(dá)水平，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。Western Blot結(jié)果顯示，神經(jīng)元在OGD0h，lh，3h，6

5、h，12h后，IkBα的表達(dá)水平隨OGD時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，在12h達(dá)到最低；而神經(jīng)元細(xì)胞核NF-kB p65的表達(dá)水平在lh開(kāi)始上升，12h達(dá)到峰值。給與Matrine后，Matrine(50-200 uM)能劑量依賴性地升高神經(jīng)元IkBα的表達(dá)水平，降低神經(jīng)元細(xì)胞核NF-kB p65的表達(dá)水平。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步顯示:OGD3h神經(jīng)元NF-kB的核轉(zhuǎn)位顯著增加，6-12h達(dá)高峰(P<0.01);Matrine可顯著抑制OGD12h誘導(dǎo)

6、的神經(jīng)元NF-kB p65核轉(zhuǎn)位(P<0.05，P<0.01)。Real Time PCR結(jié)果顯示:與NF-kB p65核轉(zhuǎn)位的高峰時(shí)間相一致，OGD12h明顯誘導(dǎo)神經(jīng)元NF-kB的靶基因p53和c-MycmRNA表達(dá)(P<0.01)，而Matrine可顯著下調(diào)p53和c-Myc mRNA的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。
　　 結(jié)論:1.證實(shí)了Matrine對(duì)缺血性神經(jīng)元損傷具有直接保護(hù)作用，并能抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。