細胞內抗體敲除血管內皮細胞MHC-1的作用研究.pdf

1、背景及目的：用健康的組織器官代替病變、衰竭的器官而重建其正常的生理功能，一直是臨床醫(yī)生追求的目標，但同種異體移植物在移植后出現(xiàn)排斥反應，造成移植物功能喪失，多年來，臨床及實驗室工作者一直努力尋找減輕及消除排斥反應的方法；目前預防和治療排斥反應的方法分為非藥物治療及藥物治療，前者在過去的免疫抑制治療中使用過，比如射線輻射、胸導管插管淋巴引流、脾切除及局部免疫抑制等，但其中一些不良反應較多，現(xiàn)已很少使用。免疫抑制藥物治療是當今應用最多的，新

2、型的免疫抑制藥物不斷的推出，給臨床工作帶來了極大的幫助，但長期服用免疫抑制劑所引起的諸如感染，惡性腫瘤以及免疫抑制劑本身的毒副作用等，極大地影響了器官或細胞移植的成功率和受者的長期存活率。隨著基因工程重組技術的發(fā)展，能夠誘導耐受、減緩排斥反應，更具有特異性的基因治療為我們開辟了新的治療途徑。MHC-Ⅰ抗原作為異體移植物的主要攻擊靶點，如果降低MHC-Ⅰ在供體細胞上的表達抑或敲除MHC-Ⅰ抗原，則可能大大減輕、甚至避免排斥反應發(fā)生。為此，

3、本研究構建針對人類MHC-Ⅰ細胞內抗體的腺相關病毒，轉染人臍靜脈內皮細胞，驗證MHC-Ⅰ細胞內抗體在人臍靜脈內皮細胞中的打靶作用，探討其在移植免疫排斥反應中的作用和意義。 方法：1．應用PCR技術和T載體克隆法克隆抗MHC-Ⅰ細胞內抗體基因（F105VH-scFv-KDEL），酶切鑒定，并進行DNA測序及分析。2．酶切獲取F105VH-scFv-KDEL融合基因片段，將其插入質粒pSSHG腺相關病毒載體中的EcoRⅠ-BamHⅠ

4、位點，構建重組腺相關病毒載體質粒pSSHG/F105VH-scFv-KDEL。3．用腺病毒輔助質粒pFG140、包裝質粒pAAV/Ad及已構建的重組腺相關病毒載體質粒，三質粒磷酸鈣共沉淀法轉染293細胞系，包裝重組攜帶F105VH-scFv-KDEL融合基因的腺相關病毒載體。經斑點雜交方法測定重組病毒滴度。4．將人臍靜脈內皮細胞系ECV304細胞分為重組腺相關病毒組及PBS對照組，前者以重組腺相關病毒感染ECV304，后者以等量PBS液

5、處理；RT—PCR方法檢測F105VH-scFv-KDEL基因片段是否成功整合入人臍靜脈內皮細胞。5．免疫細胞化學方法對比重組腺相關病毒組及PBS組細胞表面MHC-Ⅰ的表達情況。6．微量細胞毒實驗方法觀察兩組細胞的存活狀況。 結果：1．F105VH-scFv-KDEL融合基因經酶切電泳鑒定正確，經DNA測序與Genebank序列完全一致。2．pSSHG/MHC-Ⅰ酶切圖譜證實MHC-Ⅰ細胞內抗體基因片段克隆入pSSHG/CMV質

6、粒載體中。3．斑點雜交測定病毒的滴度為3．4×109-3．4×1010PFU/ml。4．RT-PCR檢測到F105VH-scFv-KDEL基因片段成功整合入人臍靜脈內皮細胞。5．免疫細胞化學方法檢測到ECV304細胞表面MHC-Ⅰ的表達，對比顯示，重組腺相關病毒組細胞表面MHC-Ⅰ的表達明顯少于PBS組。6．微量細胞毒實驗方法證實重組腺相關病毒組存活細胞明顯多于PBS組。 結論：1．成功克隆F105VH-scFv-KDEL融合基