雞血管內(nèi)皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Vezf1)在血管內(nèi)皮細(xì)胞分化與血管生成中的作用研究.pdf

1、血管系統(tǒng)的形成始于胚胎中胚層形成過程中其部分細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。這些細(xì)胞經(jīng)過進(jìn)一步增殖、分化，并通過移行、聚集、極化形成最初的血管網(wǎng)絡(luò)，該過程稱為血管發(fā)生(vasculogenesis)。伴隨胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，這一初始血管網(wǎng)絡(luò)通過被統(tǒng)稱為新血管生成(angiogenesis)的過程而改建與生長(zhǎng)，最終形成由多級(jí)血管組成的功能血管系統(tǒng)。與此同時(shí)，各級(jí)血管在血管壁細(xì)胞(周細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等)生成過程中成熟穩(wěn)定。因此，血管系統(tǒng)形成的整

2、個(gè)過程實(shí)際上是血管內(nèi)皮細(xì)胞與其周圍細(xì)胞相互作用的過程，血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管生成的中心細(xì)胞。 為了探討血管內(nèi)皮細(xì)胞分化機(jī)制，我們從發(fā)育至三體節(jié)的雞胚中克隆一些血管內(nèi)皮(前體)細(xì)胞特異表達(dá)的基因。我選擇新近在小鼠新發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子-1(Vezfl)的同源基因進(jìn)行研究，該基因被報(bào)道在早齡鼠胚的血管內(nèi)皮及其前體細(xì)胞中特異性表達(dá)。期望對(duì)雞Vezf1基因的功能分析，進(jìn)一步揭示血管內(nèi)皮細(xì)胞分化及血管形成的細(xì)胞與分子機(jī)制。 我們

3、首次采用RNAi技術(shù)在雞胚上對(duì)Vezfl的功能進(jìn)行研究，并通過免疫磁珠的方法分離雞血管內(nèi)皮祖細(xì)胞研究Vezf1對(duì)其分化的影響。我們針對(duì)VezflmRNA序列，構(gòu)建Vezf1的干擾載體pPRIME-CMV-GFP-cVEZF1-microRNA，通過三質(zhì)粒系統(tǒng)在293T細(xì)胞中包裝成病毒顆粒，用病毒體外感染雞血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和感染早期活體雞胚，取得如下結(jié)果： 1、成功構(gòu)建雞Vezf1 RNAi系統(tǒng)pPRIME-CMV-GFP-cVEZ

4、F1-microRNA重組質(zhì)粒，在雞胚細(xì)胞中檢測(cè)其基因沉默效率達(dá)75％左右。 2、對(duì)不同時(shí)期的早期雞胚做Whole-mount原位雜交，分析了cVezf1 mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。 3、制備了兔抗雞VEZF1多克隆抗體，經(jīng)Elisa檢測(cè)抗體滴度達(dá)10000以上。 4、用Dynal免疫磁珠法成功分離原代雞內(nèi)皮祖細(xì)胞，純度達(dá)90％以上。 5、雙色免疫組化證實(shí)了VEZF1在雞內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。 6、雞胚活