人循環(huán)纖維細胞的培養(yǎng)、鑒定及中藥藥理血清的干預作用.pdf

1、本實驗室根據以往對中醫(yī)藥抗多器官纖維化研究的積累，通過對中醫(yī)“異病同治”理論內涵的深入思考，結合現代醫(yī)學研究成果，提出了中醫(yī)藥干預多器官纖維化作用于“骨髓一血液一靶器官”軸的假設。已有研究發(fā)現成人外周血中存在一種與多器官纖維化疾病相關的白細胞亞群——循環(huán)纖維細胞具有分泌細胞外基質的功能，來源于骨髓，存在于外周血，是一種過渡型細胞，能夠隨血液遷移到損傷組織中，進一步分化、成熟為成纖維細胞和肌成纖維細胞。 [目的] 從成人外周血中分

2、離、純化循環(huán)纖維細胞，建立起穩(wěn)定、可靠的培養(yǎng)手段和鑒定方法，了解體外培養(yǎng)的循環(huán)纖維細胞的生物學特征和功能，建立起循環(huán)纖維細胞體外分化、生成細胞外基質的細胞模型，并在以往研究復方鱉甲軟肝方防治多器官纖維化的基礎上，進一步探討方中的兩個組成藥物：黃芪和莪術的藥理血清對循環(huán)纖維細胞的干預作用。 [方法] 實驗采用Ficoll梯度密度離心的方法分離成人外周血，獲得“白衣”層單個核細胞后，研究了接種密度、共培養(yǎng)時間、血清濃度等因素對循環(huán)纖

3、維細胞培養(yǎng)、分化的影響。結合流式細胞檢測技術、細胞免疫熒光染色和細胞化學染色技術，對體外培養(yǎng)的人循環(huán)纖維細胞進行了鑒定，并與人骨髓間充質細胞、人胚肺成纖維細胞和人血管內皮細胞進行了比較，同時通過掃描電鏡和透射電鏡觀察，進一步對循環(huán)纖維細胞的形態(tài)進行了鑒定。通過天狼星紅染色、羥脯氨酸含量測定和Western blotting比較了不同培養(yǎng)時期的人循環(huán)纖維細胞和人胚肺成纖維細胞的形態(tài)學特征和功能。在對人循環(huán)纖維細胞體外進行培養(yǎng)、分化研究的基

4、礎上，進一步研究了復方鱉甲軟肝方中的兩個藥物：黃芪和莪術的藥理血清對循環(huán)纖維細胞增殖和膠原合成能力的影響。 [結果] 1 循環(huán)纖維細胞體外培養(yǎng)分化的特征體外培養(yǎng)的單個核細胞，1d后有細胞貼壁，細胞圓形、幼??；去除懸浮的淋巴細胞繼續(xù)培養(yǎng)，這些貼壁的細胞在第3d即開始分化，出現大量成束幼小的長梭形細胞；7d后細胞開始生長變大，基本呈現成纖維細胞樣形態(tài)；而到第15d細胞形態(tài)開始分化成熟，個體進一步生長，呈長梭形、紡錘形等，其大

5、小和形態(tài)基本接近典型的成纖維細胞，細胞開始變得鋪展、扁平而透明。經流式細胞儀分析，這些貼壁細胞到第9d即有83．5％細胞表達COLI蛋白。 2 循環(huán)纖維細胞體外的培養(yǎng)影響因素高密度接種雖然有利于細胞貼壁，并能加速細胞的分化節(jié)奏，但同時也黏附了大量淋巴細胞，長期與大量淋巴細胞共存，對于貼壁細胞的分化是不利的，最終將中斷其向成纖維細胞方向的分化，因此細胞貼壁后1d及時去除非貼壁細胞對于循環(huán)纖維細胞的非常關鍵。接種量為0.75×10<

6、'6>PBMCs/cm<'2>時，既能給所有細胞相互接觸作用的機會，同時也可以通過細胞代謝迅速降低培養(yǎng)液的pH，這種條件下會明顯促進貼壁細胞向長梭形的成纖維細胞樣方向分化。循環(huán)纖維細胞在含10％和20％血清的DMEM培養(yǎng)液中均能生長，前者的分化速度較慢。 3 循環(huán)纖維細胞的超微結構掃描電鏡下細胞間相互接觸，呈明顯的長梭形，核區(qū)微隆起，細胞有少數較粗的突起及纖細的絲狀偽足。透射電鏡顯示細胞內的粗面內質網豐富、擴張；胞漿中有豐富的游

7、離核糖體；高爾基體發(fā)達，在其成熟面可見大小不一的分泌囊泡；線粒體較多，體大而圓；細胞核較小，不規(guī)則，胞質豐富。循環(huán)纖維細胞具有成纖維細胞的典型形態(tài)學特征。 4 免疫熒光鑒定早期培養(yǎng)的循環(huán)纖維細胞表達干/祖細胞表面標記CD34和白細胞共同表面抗原CD45，伴隨著循環(huán)纖維細胞在體外培養(yǎng)過程中分化、成熟，這兩個表面標記逐漸消失，COL Ⅰ、COLⅢ表達增強。體外培養(yǎng)30d后終末分化的循環(huán)纖維細胞表達肌成纖維細胞標志物α—SMA，循環(huán)纖

8、維細胞不表達血管內皮細胞標志物vwF。 5 循環(huán)纖維細胞產生細胞外基質的能力Western blotting檢測了處于不同分化階段的循環(huán)纖維細胞和人胚肺成纖維細胞分泌膠原的種類，結果表明這些細胞均表達Ⅰ型和Ⅲ型膠原。和人胚肺成纖維細胞相比，循環(huán)細胞培養(yǎng)液中膠原含量較低，而細胞層中沉積膠原的含量明顯高于人胚肺成纖維細胞。 6 中藥藥理血清對循環(huán)纖維細胞的干預作用初步建立了循環(huán)纖維細胞體外分化、增殖和產生細胞外基質的細胞模型

9、，探索了藥理血清干預循環(huán)纖維細胞增殖和膠原合成兩個環(huán)節(jié)的實驗條件。通過藥理血清干預細胞模型的研究，證明黃芪能夠抑制膠原分泌減少培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量，莪術能抑制循環(huán)纖維細胞增殖。兩藥疊加對上述兩個環(huán)節(jié)沒有顯著作用。 [結論] 建立了穩(wěn)定、可靠的分離、培養(yǎng)人循環(huán)纖維細胞的方法。通過與人胚肺成纖維細胞、骨髓間充質細胞和血管內皮細胞的比較，證明了成人外周血中確實存在一種前體細胞——循環(huán)纖維細胞，經體外培養(yǎng)，能夠分化為成纖維細胞。初步掌