HCMV感染對(duì)宿主細(xì)胞周期進(jìn)程影響機(jī)制及中藥干預(yù)分子機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分HCMV感染對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程和Cyclins表達(dá)的影響 目的：觀察HCMV感染對(duì)宿主細(xì)胞DNA合成及Cyclins表達(dá)的影響。 方法：用HCMVAD169毒株感染人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL)，測(cè)定病毒感染性滴度及建立感染性模型。通過(guò)接觸抑制使細(xì)胞同步化于G0/G1期，用MOI=5PFU/percell的病毒感染HEL，分別于感染后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h終止培養(yǎng)。用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HCM

2、V感染后細(xì)胞周期進(jìn)程及DNA含量。用WesternBlot法檢測(cè)CyclinE、CyclinA、CyclinD1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：HCMV感染細(xì)胞后24h～96h，S期細(xì)胞明顯增多，G2/M期細(xì)胞減少，至感染后96h，未發(fā)現(xiàn)有G2/M期細(xì)胞。感染后24h細(xì)胞保持2NDNA含量，全部感染細(xì)胞DNA含量在48h內(nèi)開(kāi)始升高，感染后72h多數(shù)細(xì)胞的DNA含量大于2NDNA含量，但未發(fā)現(xiàn)有4NDNA含量的細(xì)胞。在正常對(duì)照細(xì)胞DNA含量沒(méi)

3、有增加。HCMV+PAA組沒(méi)有檢測(cè)到DNA含量增加。HCMV感染接觸抑制細(xì)胞12h時(shí)CyclinE蛋白被誘導(dǎo)，感染后24h出現(xiàn)CyclinE峰值；HCMV不能誘導(dǎo)CyclinA蛋白表達(dá)；CyclinD1沒(méi)有被誘導(dǎo)，且在感染后24h開(kāi)始下降。 結(jié)論：HCMV感染同步化于G0/G1期的細(xì)胞后，誘導(dǎo)CyclinE蛋白明顯升高，激活CyclinE/Cdk2激酶，使細(xì)胞周期越過(guò)G1/S限制點(diǎn)，將細(xì)胞周期阻止于晚G1期。病毒感染未能激活細(xì)胞

4、DNA合成，病毒感染后總DNA的增加由病毒DNA復(fù)制造成。 第二部分HCMV感染對(duì)宿主細(xì)胞Cdk2的影響 目的：觀察HCMV感染細(xì)胞Cdk2的亞細(xì)胞定位，研究HCMV感染對(duì)Cdk2蛋白水平及對(duì)CyclinE/Cdk2激酶活性的影響。 方法：通過(guò)接觸抑制使細(xì)胞同步化于G0/G1期，用MOI=5PFU/percellHCMVAD169毒株感染人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL)，用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分別測(cè)定HCMV感染

5、前及感染后24hCdk2亞細(xì)胞定位；Westernblot法測(cè)定HCMVCdk2蛋白豐度；用免疫沉淀，激酶活性分析法檢測(cè)HCMV感染細(xì)胞內(nèi)Cdk2的活性。 結(jié)果：接觸抑制阻止在G0期細(xì)胞Cdk2游離在細(xì)胞質(zhì)，HCMV感染24小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致Cdk2從細(xì)胞漿移位到細(xì)胞核。同時(shí)HCMV感染可引起cyclinE/Cdk2激酶的強(qiáng)烈激活，但HCMV感染并不誘導(dǎo)Cdk2蛋白豐度增加。 結(jié)論：HCMV感染G0/G1細(xì)胞，在24h內(nèi)導(dǎo)致Cd

6、k2從細(xì)胞漿移位到細(xì)胞核。使之與細(xì)胞核內(nèi)的調(diào)節(jié)亞單位CyclinE結(jié)合，激活CyclinE/Cdk2激酶。使細(xì)胞周期越過(guò)G1/S限制點(diǎn)，進(jìn)展至晚G1期。 第三部分中藥金葉敗毒制劑對(duì)HCMV感染細(xì)胞cip1、kip1基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響 目的:研究中藥金葉敗毒制劑對(duì)HCMV感染細(xì)胞的周期調(diào)控抑制基因cip1、kip1蛋白表達(dá)及cip1mRNA水平的影響，探討中藥金葉敗毒制劑體外對(duì)HCMV感染的阻斷效應(yīng)及其機(jī)制。

7、 方法:通過(guò)接觸抑制使細(xì)胞同步化于G0/G1期，用MOI=5PFU/percell的病毒感染HEL，分別于感染后0h、24h、48h、72h、96h終止培養(yǎng)。采用RT-PCR法及Westernbiot法，分別檢測(cè)HCMV感染后0h、24h、48h、72h、96h細(xì)胞中cip1mRNA水平及cip1、kip1蛋白豐度，檢測(cè)中藥金葉敗毒制劑干預(yù)后cip1mRNA水平及cip1、kip1蛋白豐度的變化。 結(jié)果:病毒感染后0h、2