自體筋膜作為骨骼肌再生支架的實驗研究.pdf

1、一、 研究背景 肌肉缺損是臨床常見現(xiàn)象，常由各種創(chuàng)傷包括深度燒傷、電損傷、車禍等意外事故引起。肌肉組織的修復是醫(yī)學界較為棘手的課題，盡管游離肌肉移植以其動力修復的顯著療效為外科醫(yī)生所青睞，然而它對供區(qū)的損害及術后受區(qū)欠佳的外形和肌力分布限制其廣泛應用。近年來隨著細胞生物學的迅猛發(fā)展和組織工程的興起，為肌肉的缺損和動力修復開創(chuàng)了一個嶄新的研究前景。自從20世紀80年代中期提出組織工程概念后，許多學者試圖利用組織工程方法在體外構(gòu)

2、建具有功能的肌肉組織。但是，迄今為止仍然沒有理想的組織工程化肌肉能滿足臨床需要。究其原因，主要是尚無理想的供肌肉組織再生的支架材料。在肌肉再生研究中，種子細胞賴于生存的支架材料的研究就成為重要的內(nèi)容。 組織工程的支架材料可分為：1，天然高分子材料。 常用的天然高分子材料主要為多糖和蛋白質(zhì)兩大類。多糖類有纖維素、甲殼素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等；蛋白質(zhì)材料主要有膠原和纖維蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白。這類材料的優(yōu)點在于包含著許多生物信息，能夠

3、使細胞產(chǎn)生或維持各種功能，并具有很好的生物相容性，與活體組織接觸后一般小會引起血液凝固、炎癥或排斥反應等。但是天然材料在大規(guī)模生產(chǎn)過程中會發(fā)生質(zhì)量、性能和結(jié)構(gòu)變化，并且材料來源有限，價格昂貴。2，合成高分子材料。常有脂肪族聚酯、醫(yī)用聚氨酯、聚氨基酸、醫(yī)用硅橡膠等。具有良好的物理機械性能，可以精確地控制其分子量，設計過程中能對許多性能進行控制，易加工成不同形狀等優(yōu)點。但生產(chǎn)成本高，在體內(nèi)降解較快，羥基乙酸在局部積累還會使局部酸性增強而導致

4、細胞中毒甚至死亡。3，生物衍生材料。人或動物來源的材料，經(jīng)過去細胞、部分或完全去有機質(zhì)或無機質(zhì)、去抗原等處理，形成生物衍生材料。生物衍生材料具有最接近人體的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)、生物力學性能和部分活性因子，有利于細胞的黏附、生長及發(fā)揮生理功能。材料本身所保留的成分具有引導或誘導組織再生的能力，因此是具有良好應用前景的一類支架材料。但存在傳播疾病和倫理學問題。 不論應用何種支架材料，都需滿足以下五項要求：①無毒性。②可塑性，可制備成所需要的

5、形態(tài)。③多孔性(或)表面貼附性，允許細胞棲息、代謝、增殖生長和分化。④無免疫原性。⑤可降解性，在體內(nèi)能被消化或排除體外。 因此，綜合以上因素考慮利用自身組織進行肌肉組織工程研究既可以避免免疫排斥反應和倫理學爭論，又避免了天然材料在生產(chǎn)過程中質(zhì)量、性能、結(jié)構(gòu)變化及來源有限、價格昂貴等缺點，還避免了合成高分子材料在體內(nèi)易降解、局部積累致局部細胞中毒甚至死亡的缺點。 筋膜組織用于修復面神經(jīng)癱瘓、部分組織缺損已在臨床應用

6、多年。部分筋膜的缺失不影響整塊肌肉功能。筋膜具有一定抗張強度。用自體筋膜作支架，其優(yōu)點為：①無免疫排斥反應。②筋膜上殘存血管利于與周圍血管建立循環(huán)，為移植組織提供營養(yǎng)成分。⑧筋膜上殘存神經(jīng)通路利于與周圍神經(jīng)建立聯(lián)絡和神經(jīng)分布。④筋膜上殘存的成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等可分泌多種細胞因子利于構(gòu)建具有正常功能的肌肉組織。利用筋膜的特性作為肌肉組織工程支架材料是本研究的創(chuàng)新之處。 二、研究內(nèi)容和方法： 第一部分

7、 體外骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)、鑒定 目的 體外培養(yǎng)能達到移植要求的肌衛(wèi)星細胞數(shù)或肌肉組織。 方法 新西蘭兔4只，隨機將一側(cè)后腿脛骨前肌輕度電擊損傷，取傷后48小時和對側(cè)未損傷肌肉組織各2克，進行組織塊培養(yǎng)和酶消化培養(yǎng)。培養(yǎng)7、10和14天細胞計數(shù)，培養(yǎng)3周行Desmin免疫組化檢測。 結(jié)果 體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞操作繁瑣，易污染，成功率低，Desmin免疫組化染色陽性率＜50％。有無電損傷的組織塊培養(yǎng)和

8、酶消化培養(yǎng)的最終細胞數(shù)無顯著差別，其細胞數(shù)量達不到移植要求，亦未見肌肉組織的形態(tài)及結(jié)構(gòu)。 結(jié)論 體外骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)困難且達不到移植要求。 第二部分 自體筋膜構(gòu)建肌肉再生組織支架的研究 目的 探討自體筋膜作為支架材料在體內(nèi)構(gòu)建肌肉再生的可行性。 方法 新西蘭兔28只，建立兔后腿脛骨前肌中段缺損模型后，隨機將一側(cè)后腿作為研究組(組1，n=28)，另一側(cè)為對照組，又分3個亞組(組

9、2，n=10；組3，n=10；組4，n=8)。組1用自體闊筋膜(支架)連接肌肉缺損處，并取離斷的肌肉組織微粒種植于支架內(nèi)，原位縫合皮下組織和皮膚；組2白體闊筋膜(支架)連接肌肉缺損處，不種植肌肉組織微粒；組3，缺損處僅種植肌肉組織微粒；組4，缺損處不作任何處置。實驗后2、3、4、6和9周解剖觀察移植成功率、形態(tài)，并切取標本進行組織學、超微結(jié)構(gòu)觀察和Desmin免疫組化鑒定，以及觀察肌肉組織微粒在筋膜支架中的生長情況。 結(jié)果

10、①移植后4周：組l,27(>93％)條移植成功，大體觀察缺損愈合處外觀逐漸接近正常形態(tài)，1條肌肉近端連接處斷裂；組2，4條移植物斷裂，6條移植物雖然連接于缺損處，但是外觀仍舊凹陷；組3種植的肌組織微粒部分呈現(xiàn)豆腐渣樣改變；組4缺損處無變化。②組織學及超微結(jié)構(gòu)觀察，組1有大量細胞增生，2至3周時細胞增生最活躍，細胞附于纖維結(jié)締組織兩側(cè)，在透射電鏡下見細胞的線粒體、高爾基體等結(jié)構(gòu)增生活躍，顯示細胞代謝旺盛。并可見細胞融合現(xiàn)象。組2在光鏡下多

11、為纖維結(jié)締組織，在透射電鏡下顯示為膠原樣組織；③免疫組化結(jié)果顯示：移植后4周時組1 Desmin陽性細胞>85％，而組2陽性細胞<25％。 結(jié)論①肌肉組織微粒移植于筋膜支架活體內(nèi)培養(yǎng)簡易可靠；②自體筋膜可作為肌肉組織再生的支架材料。第三部分 再生肌肉組織生物特性研究 目的研究自體筋膜作為支架材料的再生肌肉組織特性和功能。 方法第二部分研究的28只新西蘭兔在實驗后2、3、4、6和9周解剖觀察

12、外，組1和組2連接物中段切取標本用RT-PCR方法進行α-actin cDNA和troponin cDNA相對定量分析。8只兔按第二部分組1和組2方法實驗后8個月進行電生理功能檢測。 結(jié)果①α-actin cDNA相對定量分析，比較組1和組2差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而troporlin cDNA兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)：②組1和組2實驗8個月時行電生理功能檢測結(jié)果相似，都具有電傳導性，肌肉收縮現(xiàn)象未引

13、出。 結(jié)論具有肌肉組織微粒的自體筋膜支架組肌細胞含量明顯高于無肌肉微粒的自體筋膜支架組，但其生理功能及特性需要進一步觀察。 三、研究結(jié)果 l，體外培養(yǎng)肌衛(wèi)星細胞不易達到移植要求，操作繁瑣，易污染。 2，肌肉組織微粒種植于筋膜支架上活體培養(yǎng)生長良好，2至3周后即見大量肌衛(wèi)星細胞。無肌肉組織微粒的自體筋膜支架或無自體筋膜支架的肌肉組織微粒體內(nèi)生長差或不生長。 3，具有肌肉組織微粒

14、的自體筋膜支架兩側(cè)有大量組織細胞，透射電鏡觀察見有細胞融合現(xiàn)象。而無肌肉組織微粒的自體筋膜支架未見大量組織細胞，也無細胞融合現(xiàn)象。 4，肌肉組織微粒的自體筋膜支架組Desmin陽性細胞>85％，而無肌肉組織微粒的自體筋膜支架組Desmin陽性細胞<25％。 5，α-actin cDNA相對定量分析，肌肉組織微粒的自體筋膜支架組含量高于無肌肉組織微粒的自體筋膜支架組(P<0.05)。而troporlinDNA含