大鼠骨髓干細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化為骨骼肌治療骨骼肌缺損的動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的] 驗(yàn)證大鼠骨髓干細(xì)胞(MSCs)體外培養(yǎng)的方法及其生物學(xué)特性，研究MSCs的多項(xiàng)分化潛能以及其在體外定向誘導(dǎo)分化為骨骼肌細(xì)胞，設(shè)計(jì)一組動(dòng)物模型，分別將誘導(dǎo)后、未誘導(dǎo)的MSCs、陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞注射到動(dòng)物模型體內(nèi)，研究MSCs在體內(nèi)的誘導(dǎo)分化情況及其最終的形態(tài)變化；從而，找到肌肉缺損最佳的修復(fù)方法，為臨床治療開(kāi)拓廣闊的前景。 [方法] 首先培養(yǎng)大鼠骨髓干細(xì)胞(MSCs)、大鼠骨骼肌細(xì)胞(Mb，主要用于陽(yáng)性對(duì)照)，將體外培養(yǎng)的

2、：MSCs第三代用5-氮雜胞苷誘聯(lián)合MyoD、TGF-β1、IGF-1導(dǎo)分化，用免疫組織化學(xué)方法鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞。制做動(dòng)物模型：取16只10周齡的Wistar大鼠，在其左后小腿脛前肌中部注射無(wú)水乙醇0.2ml，使其脛前肌中部變性壞死。右后小腿脛前肌中部注射無(wú)菌生理鹽水0.2ml。將16只大鼠模型隨機(jī)分成四組，第一組陰性對(duì)照，只注射培養(yǎng)基；第二組實(shí)驗(yàn)組，注射MSCs；第三組實(shí)驗(yàn)組，注射誘導(dǎo)后的MSCs；第四組陽(yáng)性對(duì)照組，注射Mb。分別將第

3、三代細(xì)胞、誘導(dǎo)后的細(xì)胞用BrdU標(biāo)記，然后收集等待注射。動(dòng)物模型建立4h后，就可以注射。注射部位雙小腿脛前肌中部。在注射細(xì)胞后的第3d、6d、9d和12d分別取材進(jìn)行形態(tài)觀察和免疫學(xué)檢查； [結(jié)果] 大鼠MSCs體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，形態(tài)不規(guī)則，流式細(xì)胞儀檢測(cè)絕大部分細(xì)胞處于G1期(79.4％)，免疫組化檢測(cè)CD44陽(yáng)性，而CD34陰性。大鼠Mb體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，形態(tài)規(guī)則，流式細(xì)胞儀檢測(cè)絕大部分細(xì)胞處于G1期(79.8％)，免疫組化

4、檢測(cè)Desmine，Myosin均陽(yáng)性。經(jīng)誘導(dǎo)后MSCs，形態(tài)多為三角性或纖維狀，兩周后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)絕大部分細(xì)胞處于G1期(67.6％)，免疫組化檢測(cè)Desmine，Myosin均陽(yáng)性，三周后有肌小管形成。在術(shù)后3d、6d，第一組沒(méi)有或很少BrdU標(biāo)記細(xì)胞(假陽(yáng)性)，組織切片免疫組化Desmine，Myosin抗體陰性；第二組 BrdU標(biāo)記細(xì)胞很多，組織切片免疫組化兩種抗體陰性或弱陽(yáng)性：第三、四組BrdU標(biāo)記細(xì)胞很多，向骨骼肌細(xì)胞分

5、化，均為陽(yáng)性表達(dá)； 9d、12d可見(jiàn)第一、二組兩種抗體弱陽(yáng)性表達(dá)；第三、四組BrdU標(biāo)記細(xì)胞明顯增多，Desmine，Mvosin強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)BrdU標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)，運(yùn)用配伍組設(shè)計(jì)資料的方差分析，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)MSCs注入體內(nèi)分化成骨骼肌能力明顯大于未經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的MSCs，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)體內(nèi)誘導(dǎo)MSCs在體內(nèi)增殖分化明顯增強(qiáng)的時(shí)間是在9d以后，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 [結(jié)論]大鼠骨髓干細(xì)胞具有多