自體骨骼肌衛(wèi)星細胞注射治療女性壓力性尿失禁的實驗研究.pdf

1、本研究的目的是建立大鼠骨骼肌衛(wèi)星的原代分離、純化方法，觀察大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的體外增殖、成肌特性。 研究方法：(D采用膠原酶、胰蛋白酶改良兩步酶消化法，分離獲取大鼠骨骼肌組織中的單個核細胞，利用不同細胞群貼壁能力的差異，通過差速貼壁法去除成纖維細胞等雜質細胞，使骨骼肌衛(wèi)星細胞得以純化。(2)倒置相差顯微鏡觀察體外培養(yǎng)時細胞的增殖情況和形態(tài)的變化。(3)免疫組化鑒定所分離的骨骼肌衛(wèi)星細胞肌性標志desmin。(4)倒置相差顯微鏡下

2、觀察不同處理條件下原代分離的骨骼肌衛(wèi)星細胞的成肌特性。 研究結果：(1)改良兩步酶消化法結合差速貼壁技術，可以分離得到較高純度的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞，Desmin免疫組化鑒定純度在85％以上。(2)骨骼肌衛(wèi)星細胞貼壁速度慢，培養(yǎng)皿需要用多聚賴氨酸處理，細胞接種24小時后大多數(shù)骨骼肌衛(wèi)星細胞完成貼壁。細胞形態(tài)呈梭形，與成纖維細胞形態(tài)相似，屬纖維細胞型。(4)成肌特性觀察：當細胞密度較大(生長匯合至60％-70％)或降低培養(yǎng)基血清濃度

3、(含2％胎牛血清和2％馬血清的DMEM培養(yǎng)基)，細胞之間開始相互融合形成肌管細胞。所形成的肌管細胞具有多細胞核特征，肌管細胞之間也可以相互融合，外觀形態(tài)上更加粗大，最終可連接成網狀。在培養(yǎng)條件良好時有時可以觀察到肌管細胞的自發(fā)收縮。 研究結論：改良兩步酶消化法結合差速貼壁技術是一種簡便易行、獲得較高純度骨骼肌衛(wèi)星細胞的方法。骨骼肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)時無需特殊誘導即可相互融合，形成具有自發(fā)收縮特性的多細胞核肌管細胞。 研究目

4、的：IGF-1對大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖刺激效應。探討IGF-1刺激骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的機理。 研究方法：(1)IGF-1對骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖刺激效應。IGF-1分為2ng／ml，20ng／ml，50ng／ml，100ng／ml共四組，并設置空白對照組(不加IGF-1)。培養(yǎng)24、48小時，MTF法觀察不同濃度的IGF-1在不同時間點對骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖刺激效應。(2)western-blotting檢測IGF-1刺激骨骼肌

5、衛(wèi)星細胞后P13K信號通路效應分子的改變。取原代分離后傳第二代骨骼肌衛(wèi)星細胞接種于10em培養(yǎng)皿，DMEM增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞增殖到30％-．-40％匯合后實驗。分三組：空白對照組(5％FBS)，IGF-1組(5％FBS+20ng／mlIGF-1)，IGF-I+LY294002組(5％FBS+20ng／mlIGF-1+20uMLY294002)。無血清培養(yǎng)基同步化處理16小時后，加入相應的干預因素，其中LY294002組在更換培養(yǎng)基前用L

6、Y294002(20uM)預處理1小時。干預因素處理2小時后，抽提蛋白，western-blotting測定FOX01、磷酸化FOX01以及P27Kipl蛋白水平表達的改變。共收集5份標本實驗。(3)RT-PCR同時檢測P27KipImRNA表達的改變。 研究結果：(1)2ng／mlIGF-1對骨骼肌衛(wèi)星細胞有輕微的增殖刺激效應。從20ng／ml濃度開始，IGF-1能明顯刺激骨骼肌衛(wèi)星細胞的快速增殖，更高濃度的IGF-1(50n

7、g／ml，100ng／m1)與20ng／ml的增殖刺激效應相比無顯著差異。(2)IGF-1刺激后骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖迅速，容易因為細胞密度過大融合形成缺乏增殖能力的多細胞核肌管細胞。因此，利用IGF-1體外擴增骨骼肌衛(wèi)星細胞時應密切觀察細胞的增殖情況，及時傳代和更換培養(yǎng)基。(3)IGF-1作用于骨骼肌衛(wèi)星細胞后，P13K信號通路效應分子FOX01蛋白磷酸化水平增加，磷酸化、非磷酸化FOX01比值增加。細胞周期負性調節(jié)因子P27Kipl蛋白

8、出現(xiàn)下調，且P27raplmRNA的表達也出現(xiàn)明顯的下調。 研究結論：(1)20ng／ml濃度的IGF-1足以刺激骨骼肌衛(wèi)星細胞的體外快速、大量增殖?？梢栽诙唐趦壤脭?shù)量有限的組織快速獲取大量骨骼肌衛(wèi)星細胞為組織工程技術治療相關疾病服務。(2)在利用IGF-1體外擴增骨骼肌衛(wèi)星細胞時應密切觀察細胞增殖狀況，避免細胞融合。(3)IGF-1可以通過P13K細胞信號通路發(fā)揮對骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖刺激效應。在IGF-1誘導下，磷酸化FO

9、X01蛋白的增加和功能失活，使細胞周期負性調節(jié)因子P27rapl在轉錄水平出現(xiàn)下調，進入細胞周期增殖的障礙被解除，促使了骨骼肌衛(wèi)星細胞的活躍增殖。 研究目的：(1)利用大鼠構建用于實驗研究的女性壓力性尿失禁動物模型。(2)觀察骨骼肌衛(wèi)星細胞尿道周圍注射后對尿流動力學指標產生的影響及自體骨骼肌衛(wèi)星細胞尿道周圍注射后局部組織形態(tài)學的改變。 研究方法：(1)實驗分組及女性壓力性尿失禁動物模型的建立：實驗動物采用雌性SD大鼠。設

10、正常對照組(n=10)；同時建立壓力性尿失禁動物模型20只，其中一部分作為壓力性尿失禁動物模型組對照(n=10)；一部分在造模后第2個月末接受自體骨骼肌衛(wèi)星細胞尿道周圍注射治療，即細胞注射治療組(n=10)。動物模型建立采用雙側卵巢切除+反復陰道擴張法。(2)壓力性尿失禁動物模型建立后第2個月末，從大鼠后肢肌肉組織分離自體骨骼肌衛(wèi)星細胞，經IGF-1體外擴增達到足夠數(shù)量后，被注射到尿道周圍，注射位點在近段尿道后外側，使用Hamilton

11、微量注射針，每側注射細胞量為2×106個。(3)尿液控制機能評價：尿流動力學儀測定腹壓漏尿點壓。細胞注射治療組接受細胞注射治療1個月后，即本實驗開始3個月后，3組實驗動物均測定腹壓漏尿點壓，同時切取局部尿道組織，HE染色，觀察形態(tài)學變化。 研究結果：(1)女性壓力性尿失禁動物模型組腹壓漏尿點壓明顯低于正常對照組和細胞注射治療組。One-WayANOVA統(tǒng)計分析，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。(2)骨骼肌衛(wèi)星細胞注射1個月后，細

12、胞注射治療組腹壓漏尿點壓明顯高于壓力性尿失禁動物模型組，但低于正常對照組。One-WayANOVA統(tǒng)計分析差異均有統(tǒng)計學意義。(3)自體骨骼肌衛(wèi)星細胞注射后可以使注射局部尿道壁肌層增厚、肌纖維得到增強。 研究結論：(1)大鼠雙側卵巢切除+反復陰道擴張是建立女性壓力性尿失禁動物模型的較為可靠的方法。(2)骨骼肌衛(wèi)星細胞注射后能明顯提高壓力性尿失禁動物模型的漏尿點壓，對治療壓力性尿失禁有一定的療效。注射后產生的充填效應可能是腹壓漏尿