腺病毒介導(dǎo)促軟骨生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染兔自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 以復(fù)制缺陷的腺病毒Adeno-X<'TM>為基因轉(zhuǎn)移載體,制備攜帶TGF-β1和BMP-7等促軟骨生長(zhǎng)細(xì)胞因子基因的高滴度腺病毒液,感染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,利用外源性基因編碼的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)其表達(dá)軟骨細(xì)胞表型.再將軟骨前體細(xì)胞與同種異體骨基質(zhì)明膠支架相復(fù)合,在體外構(gòu)建組織工程化軟骨,移植修復(fù)兔自體膝關(guān)節(jié)軟骨缺損,觀察該方法的可行性和有效性,以期找到一種較好的修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法.方法 (1)采用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法自多種組織和細(xì)胞總RN

2、A中擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1基因,經(jīng)測(cè)序后與Genebank中序列進(jìn)行比較分析.(2)將hTGF-β1和hBMP-7基因分別亞克隆至穿梭質(zhì)粒p-Shuttle上,經(jīng)PI-SceⅠ和I-CeuⅠ雙酶切后與線性化腺病毒骨架質(zhì)粒Adeno-X連接,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒.鑒定后再經(jīng)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞,包裝出高滴度的重組腺病毒液.(3)采用密度梯度離心法自骨髓中分離培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,觀察原代及傳代MSCs

3、形態(tài)特點(diǎn)、生長(zhǎng)特性和特殊染色,探討其作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的可行性.(4)用攜帶外源性目的基因的腺病毒感染人MSCs,觀察感染前后MSCs形態(tài)及生長(zhǎng)周期的變化,利用PCR、免疫組織化學(xué)染色及Western blot鑒定重組腺病毒目的基因表達(dá)情況.(5)取兔髂骨和四肢骨,經(jīng)脫脂、脫鈣、去蛋白處理獲得骨基質(zhì)明膠,與腺病毒感染后的兔MSCs共培養(yǎng),在體外構(gòu)建組織工程化軟骨.并通過組織染色、電鏡觀察了解細(xì)胞在同種異體骨基質(zhì)明膠上粘附、生長(zhǎng)和合

4、成分泌軟骨基質(zhì)成分的情況.(6)制備兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損模型,以5'-溴-2'-脫氧尿嘧啶標(biāo)記的組織工程化軟骨移植修復(fù)缺損區(qū),同時(shí)設(shè)缺損模型自行修復(fù)組、單純骨基質(zhì)明膠修復(fù)組和未經(jīng)腺病毒感染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合骨基質(zhì)明膠修復(fù)組進(jìn)行對(duì)比.術(shù)后1月、3月取材,觀察關(guān)節(jié)面修復(fù)情況,了解修復(fù)組織中細(xì)胞的分化和其合成基質(zhì)的情況.結(jié)論 (1)用密度梯度離心法從髓腔中分離得到的單個(gè)核細(xì)胞,體外培養(yǎng)后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志證實(shí)為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞.分離獲得的