腺病毒介導促軟骨生長因子基因轉(zhuǎn)染兔自體骨髓基質(zhì)干細胞修復關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的 以復制缺陷的腺病毒Adeno-X<'TM>為基因轉(zhuǎn)移載體,制備攜帶TGF-β1和BMP-7等促軟骨生長細胞因子基因的高滴度腺病毒液,感染兔骨髓基質(zhì)干細胞,利用外源性基因編碼的生長因子誘導其表達軟骨細胞表型.再將軟骨前體細胞與同種異體骨基質(zhì)明膠支架相復合,在體外構(gòu)建組織工程化軟骨,移植修復兔自體膝關(guān)節(jié)軟骨缺損,觀察該方法的可行性和有效性,以期找到一種較好的修復關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法.方法 (1)采用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法自多種組織和細胞總RN

2、A中擴增獲得轉(zhuǎn)化生長因子β1基因,經(jīng)測序后與Genebank中序列進行比較分析.(2)將hTGF-β1和hBMP-7基因分別亞克隆至穿梭質(zhì)粒p-Shuttle上,經(jīng)PI-SceⅠ和I-CeuⅠ雙酶切后與線性化腺病毒骨架質(zhì)粒Adeno-X連接,構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒.鑒定后再經(jīng)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HEK 293細胞,包裝出高滴度的重組腺病毒液.(3)采用密度梯度離心法自骨髓中分離培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細胞,觀察原代及傳代MSCs

3、形態(tài)特點、生長特性和特殊染色,探討其作為軟骨組織工程種子細胞的可行性.(4)用攜帶外源性目的基因的腺病毒感染人MSCs,觀察感染前后MSCs形態(tài)及生長周期的變化,利用PCR、免疫組織化學染色及Western blot鑒定重組腺病毒目的基因表達情況.(5)取兔髂骨和四肢骨,經(jīng)脫脂、脫鈣、去蛋白處理獲得骨基質(zhì)明膠,與腺病毒感染后的兔MSCs共培養(yǎng),在體外構(gòu)建組織工程化軟骨.并通過組織染色、電鏡觀察了解細胞在同種異體骨基質(zhì)明膠上粘附、生長和合

4、成分泌軟骨基質(zhì)成分的情況.(6)制備兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損模型,以5'-溴-2'-脫氧尿嘧啶標記的組織工程化軟骨移植修復缺損區(qū),同時設(shè)缺損模型自行修復組、單純骨基質(zhì)明膠修復組和未經(jīng)腺病毒感染骨髓基質(zhì)干細胞復合骨基質(zhì)明膠修復組進行對比.術(shù)后1月、3月取材,觀察關(guān)節(jié)面修復情況,了解修復組織中細胞的分化和其合成基質(zhì)的情況.結(jié)論 (1)用密度梯度離心法從髓腔中分離得到的單個核細胞,體外培養(yǎng)后經(jīng)流式細胞儀檢測表面標志證實為骨髓基質(zhì)干細胞.分離獲得的