慢病毒載體介導人肝細胞生長因子在大鼠真皮間充質(zhì)干細胞的表達.pdf

1、研究背景:
　　 硬皮病是一種以皮膚和內(nèi)臟膠原纖維進行性硬化為特征的結(jié)締組織病。本病病因尚不清楚，目前主要有免疫學說、膠原合成學說和血管學說等。迄今為止，硬皮病仍無有效的防治措施?；蛑委熥鳛橐婚T新興的學科，其研究進展非常迅速。目前，基因治療在遺傳性疾病、心血管疾病和腫瘤等多種病種中都取得了喜人的成績，已被批準的基因治療方案有百例以上。在國外，脂質(zhì)體介導人肝細胞生長因子(human hepatocyte growth facto

2、r，hHGF)基因治療硬皮病已經(jīng)在實驗室初步獲得成功。該研究結(jié)果證實HGF對于改善硬皮病的皮膚硬化切實有效。但是脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移，外源治療性基因和宿主細胞的基因組不發(fā)生整合，只能夠短暫發(fā)揮作用。在人類基因治療的臨床實施中，只有穩(wěn)定表達外源治療性基因的細胞在病人體內(nèi)才能產(chǎn)生治療效果。
　　 如何有效地將外源治療性基因?qū)胧荏w細胞，是基因治療研究中的一個重要環(huán)節(jié)。盡管目前已有多種基因載體可供選擇，在人類基因治療的實施中，一般多選

3、用病毒載體。與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體(1entiviral vectors，LVs)能夠有效地感染并整合到分裂細胞和非分裂細胞中，外源基因表達持續(xù)且穩(wěn)定，具有鮮明特色。近些年來，隨著安全性設(shè)計的發(fā)展，尤其是在HIV-1基礎(chǔ)上改造而成的“自滅活”慢病毒的出現(xiàn)，大大降低了LVs潛在的生物學風險，使其在基因治療中的應(yīng)用也逐漸得以擴展。在國外，LVs已被

4、批準在基因治療某些感染性疾病和遺傳性疾病等的臨床實施方案中使用。
　　 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的原始細胞。MSCs免疫原性低，能夠向損傷部位遷移，分泌多種生物活性分子或向損傷細胞分化，發(fā)揮組織再生和修復等功能。MSCs還可以影響結(jié)締組織中的膠原代謝，產(chǎn)生抗纖維化的效應(yīng)。目前，用MSCs移植嘗試治療肺臟、腎臟和肝臟纖維化的動物實驗都已經(jīng)獲得成功

5、。另外，已有的實驗和臨床研究證明，MSCs還具有免疫抑制和抗炎效應(yīng)。因此，針對硬皮病存在自身免疫和以纖維化病變?yōu)橹?，MSCs移植可以成為今后研究硬皮病治療方案的一個方向。
　　 除外MSCs的以上生物學特性，MSCs還易于整合外源基因，可以在體外和體內(nèi)長期表達相應(yīng)產(chǎn)物，且不影響其干細胞特性，使其在基因治療中的應(yīng)用更為廣泛。HGF可以促進MSCs向損傷部位遷移，增強組織再生和修復?；贖GF和MSCs的協(xié)同作用，可以預期，將穩(wěn)定表

6、達HGF基因的MSCs回輸硬皮病動物模型體內(nèi)將會發(fā)揮更大的治療效應(yīng)。目前，體內(nèi)和體外研究表明，LVs可以有效地介導MSCs整合外源治療性基因，而且不影響其生物學特征。因此，在用HGF基因修飾的MSCs移植治療硬皮病的研究方案中，LVs是合適的基因載體。
　　 大量研究表明，骨髓、外周血和脂肪等多種組織中均存在MSCs，以骨髓來源的MSCs研究較成熟。近年來，研究者們在皮膚真皮組織中成功分離MSCs。皮膚是人體最大的器官，且取材方

7、便，出于安全性和倫理學的考慮，真皮組織是MSCs的又一重要來源途徑。
　　 綜上所述，HGF基因修飾的MSCs移植是硬皮病基因治療研究中一個可供選擇的新方案。LVs介導hHGF基因在大鼠真皮間充質(zhì)干細胞(rat dermis MSCs，rdMSCs)穩(wěn)定表達的實驗將為硬皮病的基因治療提供基礎(chǔ)。
　　 研究目的:
　　 1.慢病毒載體在體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細胞中的基因轉(zhuǎn)移效率；
　　 2.慢病毒感染后

8、，人肝細胞生長因子基因在體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細胞中的表達情況；
　　 3.人肝細胞生長因子基因轉(zhuǎn)移是否改變體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細胞的增殖特性。
　　 研究方法:
　　 根據(jù)MSCs的黏附特性采用酶消化法分離新生大鼠真皮來源的MSCs，通過細胞貼壁，傳代培養(yǎng)進行篩選。取第3代(P3)細胞進行鑒定，包括流式細胞術(shù)分析多種細胞表面分子(CD34、CD44、CD45和CD90)和油紅O染色檢測細胞體外誘導成脂

9、肪分化的潛能。hHGF-GFP-LVs以不同感染復數(shù)(multiplicity ofinfection,MOI)感染P3細胞，熒光顯微鏡下觀察熒光表達，通過GFP熒光陽性細胞計數(shù)估計慢病毒的基因轉(zhuǎn)移效率，從而確認多少的MOI是合適的。在MOI為100的條件下，hHGF-GFP-LVs和NC-GFP-LVs(陰性對照組)分別感染P3細胞。慢病毒感染以后，細胞每4天傳代培養(yǎng)，分別收集兩組P4、P6和P8細胞的培養(yǎng)上清。將標本放于-20℃，密

10、封保存。酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測細胞培養(yǎng)上清的hHGF水平。此外，收集第1、2、3、4、5、6天轉(zhuǎn)染rdMSCs和未被轉(zhuǎn)染rdMSCs(空白對照組)，利用臺盼藍拒染法進行細胞計數(shù)，分別繪制兩組細胞的細胞生長曲線，從而分析hHGF基因轉(zhuǎn)移是否改變rdMSCs的增殖特性。
　　 統(tǒng)計學方法:
　　 1.定量資料選擇算術(shù)均數(shù)±標準差(x±s)描述；
　　 2.重復測量定量資料的比較采用方差分析；
　　 3.檢驗水

11、準以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；
　　 4.實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外培養(yǎng)rdMSCs是貼壁細胞，有較強的增殖能力，呈克隆性生長。傳代培養(yǎng)至第3代，細胞形態(tài)較均一，以梭形為主；細胞表面分子流式細胞儀分析結(jié)果：CD44和CD90陽性細胞分別占99.3％和99.9％，造血細胞的表面標志CD34和CD45陽性率僅為1.1％和1.6％；細胞經(jīng)成脂肪誘導體系培養(yǎng)14天

12、，部分細胞的胞漿中可見脂滴，油紅O染色陽性。
　　 2.hHGF-GFP-LVs表達較慢，感染后72-96小時，GFP基因表達才達到高峰。慢病毒的感染效率與MOI具有量效關(guān)系。提高MOI值，可以增加病毒的感染效率。MOI為100時，LVs的基因轉(zhuǎn)移效率能夠達80％以上。
　　 3.轉(zhuǎn)染rdMSCs的細胞上清hHGF水平高于陰性對照組(F=3229.386.P＜0.05)。hHGF-rdMSCs組P4、P6和P8細胞的培養(yǎng)

13、上清hHGF水平的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4.轉(zhuǎn)染rdMSCs與空白對照組在不同時間點的細胞計數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義。兩組細胞的細胞生長曲線相似，均呈“S”形，轉(zhuǎn)染rdMSCs仍有較強的增殖能力。
　　 結(jié)論:
　　 1.在體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細胞中，慢病毒載體的基因轉(zhuǎn)移效率高；
　　 2.慢病毒載體可以介導hHGF基因在體外培養(yǎng)的大鼠真皮間充質(zhì)干細胞中穩(wěn)定表達，且不影響細胞的增殖特