小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的皮層神經(jīng)元膜電位改變在彌漫性軸索損傷中的作用.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)以白質(zhì)神經(jīng)束多發(fā)性小損傷為特征，主要臨床表現(xiàn)為深度昏迷。軸索損傷后修復(fù)的研究已經(jīng)有100多年歷史，但其具體機制仍不明確。DAI常伴有神經(jīng)源性肺水腫、肌張力異常以及癲癇等多種并發(fā)癥，在法醫(yī)學(xué)檢案中傷者的賠償請求往往因客觀證據(jù)不足而引起司法糾紛。因此明確彌漫性軸索損傷的具體機制對DAI的治療和法醫(yī)學(xué)檢案具有重要的意義。
　　小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)最

2、主要的免疫介質(zhì)，在神經(jīng)元變性和再生，炎癥性疾病以及腦外傷中均發(fā)揮了重要的作用。小膠質(zhì)細胞的激活被認(rèn)為是腦損傷的核心炎癥反應(yīng)之一，Wasserman等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有損傷時小膠質(zhì)細胞經(jīng)過復(fù)雜的“活化”過程和“形態(tài)”改變，于出血損傷的周邊區(qū)域形成一個小膠質(zhì)細胞稠密帶。本科室以往研究證實了持續(xù)活化的小膠質(zhì)細胞在DAI中發(fā)揮了促損傷的作用，而細胞生物電是細胞生命活動的基礎(chǔ)，Mandolesi G認(rèn)為電活動在神經(jīng)元的再生和修復(fù)中起著重要

3、作用，基于以上原因本實驗擬研究在彌漫性軸索損傷后，小膠質(zhì)細胞對皮層神經(jīng)元胞體的靜息電位、動作電位影響，從而進一步探討小膠質(zhì)細胞在彌漫性軸索損傷中的作用機制。
　　方法：應(yīng)用Marmarou A自由落體撞擊方法建立大鼠DAI模型。本實驗采用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重280-320g，隨機分為正常對照組；假手術(shù)組；打擊不同時間組(6、12、24、48、72、120h)；米諾環(huán)素+打擊組。觀察打擊后大鼠的行為學(xué)表

4、現(xiàn)，應(yīng)用HE染色和銀染的方法確定大鼠DAI模型建立成功。大鼠處死后，冰上快速斷頭取腦，震動切片機制取額葉皮層腦片(400μm厚)，采用全細胞電流鉗記錄模式，觀察額葉皮層神經(jīng)元的靜息電位和動作電位的變化情況。
　　應(yīng)用Clamp fit10.0(Axon Instruments)、Origin7.5和Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)的采集和分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)表示，用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)

5、計學(xué)分析。各組均數(shù)間的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較。P＜0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立了彌漫性軸索損傷模型；
　　打擊后，大鼠即刻出現(xiàn)呼吸暫停和昏迷，平均呼吸暫停時間為15.17±3.73s，平均昏迷時間為6.35±1.11min。根據(jù)大鼠行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，損傷組大鼠各項指標(biāo)均不同程度的下降，平均分

6、數(shù)為6.09±1.21。
　　HE染色結(jié)果：正常對照組和假手術(shù)組的大鼠腦干組織結(jié)構(gòu)清晰，無水腫、出血；打擊組大鼠，24h、48h時腦干部位神經(jīng)元水腫明顯，組織結(jié)構(gòu)疏松(Fig1)；
　　Bielschowsky’s鍍銀染色軸索的形態(tài)學(xué)變化：正常對照組與假手術(shù)組的大鼠神經(jīng)元軸突排列整齊，表面光滑；打擊組大鼠，24h時神經(jīng)軸索斷裂、腫脹、彎曲變形，呈串珠樣改變，可見軸索收縮球。
　　2、損傷組各時間點皮層神經(jīng)元膜電位的變化

7、情況(Fig2)；
　　打擊12h、24h組，30個皮層神經(jīng)元中，86％、83％的細胞胞膜靜息電位為-63.03±0.81mV，動作電位發(fā)放頻率達14.43±0.65/1000ms，峰振幅降低為89.25±3.26mV，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；應(yīng)用小膠質(zhì)細胞抑制劑米諾環(huán)素后，77％、70％的神經(jīng)元各項指標(biāo)明顯改善(Fig5，(Fig6)。
　　打擊48h組，30個皮層神經(jīng)元中，77％的細胞胞膜靜息電位為-7

8、2.16±0.51mV，峰振幅為106.5±1.92mV，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義；而動作電位發(fā)放頻率高達11.8±0.67/1000ms，神經(jīng)元仍表現(xiàn)出一定的興奮性，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；米諾環(huán)素可明顯抑制神經(jīng)元興奮性，與打擊48小時組相比，86％的細胞具有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig7)。
　　打擊72h組，30個皮層神經(jīng)元中，73％細胞處于明顯的超極化狀態(tài)，靜息電位達-76.3±0.8mV，峰振幅為112.67±2