NF-κB、IL-8和TLR4在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)及NF-κB Decoy ODNs對(duì)SW480細(xì)胞影響的研究.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種非特異性的結(jié)腸炎癥，病變主要累及結(jié)腸粘膜和粘膜下層。其病因和發(fā)病機(jī)理至今仍不清楚，目前大多數(shù)研究認(rèn)為與免疫反應(yīng)的異常有關(guān)。各種生化介質(zhì)，包括細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，粘附分子，一氧化氮等在介導(dǎo)這一異常的免疫反應(yīng)中起著重要作用。 許多研究己證實(shí)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)在UC的發(fā)展中對(duì)炎癥介質(zhì)中調(diào)節(jié)起著重要的作用。NF-κB是由二個(gè)亞單位組成的同源或異源二聚體，是一類能與多種基因啟動(dòng)子位點(diǎn)發(fā)生特異結(jié)合并增強(qiáng)

2、其轉(zhuǎn)錄的一種蛋白質(zhì)因子，大多數(shù)細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子部位都含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞未受到刺激時(shí)，存在于細(xì)胞漿內(nèi)未活化的NF-κB被其抑制蛋白IκB結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞受相應(yīng)的刺激后，IκB被降解，NF-κB被釋放，移位至細(xì)胞核內(nèi)與基因κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。 因此，從NF-κB角度研究潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)理進(jìn)而尋找治療新策略和新藥物是潰瘍性結(jié)腸炎研究的新方向，具有深遠(yuǎn)的理論意義和臨床實(shí)用價(jià)值。 對(duì)于UC的治療，氨基水

3、楊酸類、激素是常用有效控制癥狀藥物，但這些藥物并不能影響該病自然病程，最近幾年UC的分子病理機(jī)制研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，UC的生物基因治療有了很大發(fā)展。 隨著對(duì)腸黏膜免疫的深入研究，越來(lái)越多證據(jù)顯示腸黏膜上皮細(xì)胞(IEC)不僅作為固有屏障，而且也作為免疫活性細(xì)胞參加腸黏膜天然免疫反應(yīng)。TLR4是新近發(fā)現(xiàn)的天然免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨膜受體，是聯(lián)系天然免疫與后天免疫的橋梁。TLR4能介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)菌胞壁主要成分脂多糖(lipopoly

4、saccharide，LPS)的產(chǎn)生高反應(yīng)性，最終導(dǎo)致NF-κB激活，所以TLR4是將LPS信號(hào)由胞外傳向胞內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)分子。而IL-8是一種重要的炎癥趨化因子，能趨化腸粘膜固有層炎性細(xì)胞，放大了免疫反應(yīng)，其表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)激活的NF-κB調(diào)控。本課題通過(guò)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜上皮細(xì)胞中TLR4、IL-8、NF-κB p65的表達(dá)，及三者之間相互關(guān)系的研究，以探討其在UC發(fā)病機(jī)理中的作用。由于原代培養(yǎng)結(jié)腸上皮細(xì)胞非常困難，體外研究腸上皮細(xì)

5、胞生物學(xué)活性時(shí)，多采用與腸上皮細(xì)胞生物學(xué)特性相似的結(jié)腸腺癌細(xì)胞進(jìn)行研究。我們選用了與正常腸上皮細(xì)胞具有相似細(xì)胞免疫學(xué)特性的，并且對(duì)LPS敏感，經(jīng)LPS刺激后高表達(dá)TLR4的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞，用LPS刺激SW480細(xì)胞，在體外模擬腸道炎癥環(huán)境，探討NF-κB decoyODNs對(duì)炎癥狀態(tài)時(shí)的SW480細(xì)胞NF-κB p65 DNA結(jié)合活性和SW480細(xì)胞分泌TLR4、IL-8表達(dá)的影響。 第一部分：TLR4、IL-8

6、、NF-κB p65在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá) 目的：通過(guò)檢測(cè)人正常結(jié)腸粘膜和不同程度的UC結(jié)腸粘膜TLR4、IL-8、NF-κB p65的表達(dá)差異，探討三者在UC發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：收集UC病例及正常對(duì)照結(jié)腸鏡活檢標(biāo)本或手術(shù)標(biāo)本。采用免疫組化法檢測(cè)TLR4、IL-8、NF-κB p65的表達(dá)。根據(jù)Powell-Tuck等評(píng)分系統(tǒng)定量計(jì)算疾病活動(dòng)度(DAI)的分值。按照Truelove-Richards標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)分

7、級(jí)。 結(jié)果： 1、對(duì)照組結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞和固有層TLR4、IL-8、NF-κB p65染色均為淺棕黃色，OD值分別為(0.108±0.007；0.103±0.021；0.110±0.038)，在UC組結(jié)腸粘膜表面上皮細(xì)胞和固有層TLR4、IL-8、NF-κB p65染色為深棕黃色，OD值較對(duì)照組表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P<0.05)。 2、TLR4、IL-8、NF-κB p65表達(dá)的OD值分別與DAI呈正相關(guān)，(r=0.

8、819，p=0.001；r=0.948，.p=0.0001；r=0.945，p=0.0001)。TLR4、IL-8、NF-κB p65表達(dá)的OD值與病理分級(jí)有關(guān)，Ⅲ級(jí)、Ⅱ級(jí)與Ⅰ級(jí)比較、Ⅲ級(jí)與Ⅱ級(jí)比較差異均有顯著性(p<0.05)。TLR4、IL-8和NF-κB p65呈正相關(guān)(r=0.857，P=0.0001；r=0.980，P=O.0001)o 第二部分：NF-κB decoy ODNs對(duì)LPS刺激SW480細(xì)胞后NF-κB

9、p65 DNA結(jié)合活性的影響 目的：研究NF-κB decoy寡核苷酸對(duì)LPS刺激SW480后，對(duì)NF-κB p65DNA結(jié)合活性的影響。 方法： 1、體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞， 2、ODN序列設(shè)計(jì)合成NF-κB decoy ODNs：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5' Scrambled decoy ODNs：5'-AGTTGA

10、GGACACTTTACCAGGC-3'3'-TCAACTCCTGTGAAATGGTCCG-5' 3、用LPS(10μg/L)刺激后，用脂質(zhì)體lipofectin2000介導(dǎo)NF-κB decoyODNs轉(zhuǎn)染。 4、實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(加入同等體積含同等劑量的無(wú)血清無(wú)抗生素1640培養(yǎng)液)；LPS組：LPS刺激3h；NODN組：LPS刺激3h后轉(zhuǎn)染1μmol/L的NF.r.B decoy ODNs；SODN組：LPS刺激3h

11、后轉(zhuǎn)染1μmol/L的Scrambled ODNs；lipofectin2000組：LPS刺激3h后加入同等劑量lipofectin2000。轉(zhuǎn)染6h。 5、TransAMTM法檢測(cè)細(xì)胞核NF-κB p65的DNA結(jié)合活性和Western blot法檢測(cè)NF-κB p65細(xì)胞核含量。 結(jié)果： 1、LPS刺激SW480細(xì)胞后SW480中NF-κB P65 DNA結(jié)合活性明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，而且NF-κB

12、P65蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。 2、NF-κB decoy ODNs轉(zhuǎn)染后，SW480細(xì)胞NODN組的NF-κBP65 DNA結(jié)合活性顯著低于LPS組(P<0.01)，但是NF-κB P65蛋白表達(dá)與LPS組無(wú)明顯差異(P>0.05)。 3、Scrambled decoy ODNs組和lipofectin2000組對(duì)NF-κB P65 DNA結(jié)合活性和NF-κB P65蛋白表達(dá)與LPS組間無(wú)明顯差異(P>

13、0.05)。 第三部分：NF-κB decoy ODNs對(duì)LPS刺激SW480細(xì)胞后TLR4、IL-8表達(dá)的影響 目的：研究NF-κB decoy ODNs對(duì)LPS刺激SW480細(xì)胞后，對(duì)TLR4、IL-8表達(dá)的影響。 方法： 1、體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞， 2、ODN序列設(shè)計(jì)合成NF-κB decoy ODNs：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'3'-TCAACTCCCCTG

14、AAAGGGTCCG-5'Scrambled decoy ODNs：5'-AGTTGAGGACACTTTACCAGGC-3'3'-TCAACTCCTGTGAAATGGTCCG-5' 3、用LPS(10μg/L)刺激后，用lipofectin2000介導(dǎo)NF-κB decoy ODNs轉(zhuǎn)染。 4、實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(加入同等體積含同等劑量的無(wú)血清無(wú)抗生素1640培養(yǎng)液)；LPS組：LPS刺激3h；NODN組：LPS刺激3h后

15、轉(zhuǎn)染1μmol/L的NF-κB decoy ODNs；SODN組：LPS刺激3h后轉(zhuǎn)染1μmol/L的Scrambled ODNs；lipofectin2000組：LPS刺激3h后加入同等劑量lipofectin2000。轉(zhuǎn)染6h。 5、收集細(xì)胞上清液，用ELISA法檢測(cè)IL-8；提取細(xì)胞mRNA，經(jīng)RT-PCR法檢測(cè)TLR4mRNA、IL-8mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1、LPS刺激SW480細(xì)胞后，TLR4mR

16、NA、IL-8mRNA和IL-8的表達(dá)較對(duì)照組明顯增高(P<0.01)。 2、NF-κB decoy ODNs明顯的抑制了LPS刺激SW480細(xì)胞后TLR4mRNA、IL-8mRNA和IL-8的高表達(dá)(P<0.01)。 3、各組實(shí)驗(yàn)中用Scrambled decoy ODNs和lipofectin2000干預(yù)對(duì)TLR4、IL-8都無(wú)明顯的影響(P>0.05)。 結(jié)論： 1、在UC腸粘膜中TLR4、IL-8

17、、NF-κB p65表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明TLR4、IL-8、NF-κB p65參與了UC的發(fā)生和發(fā)展。 2、在UC中，TLR4、IL-8與NF-κB p65呈正相關(guān)。證實(shí)NF-κB p65在UC發(fā)生發(fā)展中是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)UC腸上皮炎癥反應(yīng)的基因。 3、NF-κB decoy ODNs在體外明顯抑制LPS刺激SW480細(xì)胞后的NF-κBp65的DNA結(jié)合活性。 4、NF-κB decoy ODNs在體外明顯