不同濃度嗜酸乳酸桿菌對(duì)急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效和對(duì)近、遠(yuǎn)端結(jié)腸菌群的影響及其治療機(jī)制研究.pdf

1、第一章不同濃度嗜酸乳酸桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效 目的：通過(guò)比較不同濃度嗜酸乳酸桿菌治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效，尋找治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎適宜的嗜酸乳酸桿菌濃度。 方法：實(shí)驗(yàn)用Balb/c小鼠72只，雌性，6-8周齡，體重20.0±2.0克，購(gòu)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，隨機(jī)分成9組，每組8只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下(濕度50％±10％；12h白晝/12h黑夜輪換)，喂食普通小鼠飼料。分組情況如下：(1)模型

2、組：飲用5％DSS造模；(2)生理鹽水組：5％DSS造模+NS(1ml/10g)灌胃(3)(C4組)：50/oDSS造模+1×104CFU/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(4)(C5組)：5％DSS造模+1×105CFU/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(5)(C6組)：5％DSS造模+1×106CFU/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(6)(C7組)：5％DSS造模+1＋107CFU/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(7)(C8組)：5％DSS造模+1×108CF

3、U/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(8)醋酸潑尼松組：5％DSS造模+醋酸潑尼松(45ug/lOg)灌胃；(9)正常組：正常飲食，無(wú)特殊處理。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察小鼠進(jìn)食、飲水、活動(dòng)等一般情況，稱量體重，觀察糞便性狀及糞便隱血、便血情況，計(jì)算DAI積分，評(píng)估結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)第7天，乙醚麻醉狀態(tài)下處死小鼠，解剖腹腔，觀察結(jié)腸的大體改變、測(cè)量長(zhǎng)度。于結(jié)腸距回盲部1cm處和肛門(mén)1cm處各剪取0.5cm長(zhǎng)的結(jié)腸用于細(xì)菌分析，另取肛門(mén)附近結(jié)腸組織長(zhǎng)度約

4、0.5cm于中性福爾馬林中固定，石蠟包埋切片H＆E染色，其余結(jié)腸液氮保存以備它用。 結(jié)果：中等濃度的嗜酸乳酸桿菌干預(yù)組C6(106CFU/ml濃度級(jí))組小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎癥狀緩解最明顯，DAI評(píng)分及組織損傷評(píng)分最低。 結(jié)論：嗜酸乳酸桿菌治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎有一定的量效關(guān)系，然而并非完全正相關(guān)，中等濃度(106CFU/ml濃度級(jí))組療效最佳。 第二章嗜酸乳酸桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型結(jié)腸近、遠(yuǎn)端細(xì)菌的影響 目的：

5、研究實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型鼠經(jīng)不同濃度的嗜酸乳酸桿菌治療后近、遠(yuǎn)端腸道菌群的改變 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組、模型建立及給藥方案與第一章相同，于實(shí)驗(yàn)第7天，乙醚麻醉狀態(tài)下處死小鼠，解剖腹腔，在結(jié)腸距回盲部1cm處和肛門(mén)1cm處各剪取0.5cm長(zhǎng)的結(jié)腸，稱量后滅菌勻漿器勻漿，用滅菌NS按梯度稀釋法稀釋?zhuān)x擇7種選擇性培養(yǎng)基分析腸道菌群具有代表性的厭氧菌3種(乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌)，需氧菌3種(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸球菌)及總需氧菌

6、。根據(jù)各菌菌落形態(tài)特征、革蘭染色及光鏡下特征進(jìn)行初步鑒定。對(duì)厭氧菌(雙歧桿菌及乳酸桿菌)和腸球菌培養(yǎng)分離取得純菌后，采用API試驗(yàn)條接種后讀取結(jié)果，用數(shù)字圖譜判定鑒定結(jié)果 結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組近端結(jié)腸由7種選擇性與非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)無(wú)明顯差別，遠(yuǎn)端結(jié)腸醋酸潑尼松組小鼠各種細(xì)菌特征與DSS造模組類(lèi)似，各嗜酸乳酸桿菌干預(yù)組以C6(106CFU/ml濃度級(jí))組小鼠的益生菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌)數(shù)量最多，與其余各組比較有顯著差異(p<

7、0.05)，致病菌(金黃色葡萄球菌)最低與其余各組比較有顯著差異(p<0.05)，其它選擇性培養(yǎng)基的細(xì)菌數(shù)無(wú)明顯差別。 結(jié)論： 1.嗜酸乳酸桿菌不定植于近端結(jié)腸，對(duì)近端結(jié)腸菌群無(wú)影響。 2.嗜酸乳酸桿菌能定植于遠(yuǎn)端結(jié)腸，對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸菌群有影響，增加益生菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)的生長(zhǎng)，抑制致病菌(金黃色葡萄球菌)生長(zhǎng)，以106CFU/ml濃度級(jí)組作用最明顯。 第三章嗜酸乳酸桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型Th17/

8、IL23免疫軸的影響 目的：探討不同濃度的嗜酸乳酸桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型鼠起治療作用的免疫學(xué)機(jī)制。研究嗜酸性乳酸桿菌對(duì)與IBD發(fā)病密切相關(guān)的Th17/IL23免疫軸主要相關(guān)細(xì)胞因子和信號(hào)因子：IL17、IL23、TGFβ，TNFa、STAT3和P-STAT3的影響，為進(jìn)一步探索嗜酸乳酸桿菌治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎機(jī)制以及用量提供幫助。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組、模型建立及給藥方案與第一章相同，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物留取各組結(jié)腸標(biāo)本，行

9、western blotting和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)細(xì)胞因子IL17、IL23、TGFB、TNFa及信號(hào)因子STAT3和P-STAT3的表達(dá)量，以及免疫組化檢測(cè)信號(hào)因子STAT3，P-STAT3在結(jié)腸組織的表達(dá)部位及表達(dá)量。 結(jié)果：各項(xiàng)指標(biāo)的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平顯示：均為模型組最高，NS組次之，醋酸潑尼松組較模型組有明顯降低。 對(duì)于不同濃度的嗜酸乳酸桿菌組，結(jié)果顯示：Th17細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子(I

10、L23、TGFB)以105CFU/mL組表達(dá)量最低，且效果優(yōu)于醋酸潑尼松組(p<0.05)。Th17細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)因子(STAT3，p-STAT3)，以105CFU/mL、106CFU/mL組表達(dá)量最低，效果優(yōu)于醋酸潑尼松組(p<0.05)，其中STAT3的檢測(cè)中RT-PCR和免疫組化方法檢測(cè)結(jié)果顯示106CFU/mL組檢測(cè)量最低，105CFU/mL、104CFU/mL、107CFU/mL組次之，優(yōu)于醋酸潑尼松組(p<0.05)；W

11、B方法顯示105CFU/mL組檢測(cè)量最低，106CFU/mL、104CFU/mL、107CFU/mL組次之，優(yōu)于醋酸潑尼松組(p<0.05)。關(guān)于p-STAT3表達(dá)的蛋白質(zhì)水平比較結(jié)果顯示：嗜酸乳酸桿菌干預(yù)組中免疫組化方法檢測(cè)結(jié)果顯示106CFU/mL組檢測(cè)量最低，105CFU/mL、107CFU/mL組次之，且106CFU/mL、105CFU/mL均較醋酸潑尼松組低(p<0.05)；WB方法顯示105CFU/mL組檢測(cè)量最低，106C

12、FU/mL、104CFU/mL、107CFU/mL組次之，且均較醋酸潑尼松組低(p<0.05)。Th17細(xì)胞產(chǎn)生的與機(jī)體免疫損傷和實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎形成相關(guān)的促炎因子(IL17、TNFa)以105CFU/mL組IL17表達(dá)量最低，106CFU/mL組TNFa表達(dá)量最低。 結(jié)論： 1.嗜酸乳酸桿菌干預(yù)組的Th17分化相關(guān)細(xì)胞因子(IL23、TGFB)，Th17分化相關(guān)信號(hào)因子(STAT3、p-STAT3)及實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎形成相關(guān)的