不同濃度嗜酸乳酸桿菌對(duì)急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效和結(jié)腸菌群的影響及其免疫相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：篩選能有效治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的適宜的嗜酸乳酸桿菌濃度，并對(duì)其進(jìn)行治療結(jié)腸炎的療效評(píng)價(jià)。
　　 方法：采用2.5％DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型，70只Balb/c小鼠隨機(jī)分為7組：模型組、陰性對(duì)照組(菌粉保護(hù)劑組)、陽性對(duì)照組(美沙拉嗪組)、嗜酸乳桿菌低劑量組(1×106CFU/mL，)、中劑量組(1×107CFU/mL)、高劑量組(1×108CFU/mL)、正常組。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察小鼠進(jìn)食、飲水、活動(dòng)等一般情況，稱量體重，觀察糞

2、便性狀及糞便隱血、便血情況，計(jì)算DAI積分，評(píng)估結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)第7天，乙醚麻醉狀態(tài)下處死小鼠，解剖腹腔，觀察結(jié)腸的大體改變、測(cè)量長(zhǎng)度。剪取距肛門2 cm左右病變的結(jié)腸段，縱向剖開冰生理鹽水沖洗干凈后，一部分結(jié)腸組織經(jīng)中性甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片行HE染色，其余結(jié)腸組織液氮保存以備它用。
　　 結(jié)果：模型組小鼠DAI積分及組織病理學(xué)積分要明顯高于正常組(7.81±1.02 VS0，5.80±2.94 VS0，P<0.05

3、)，嗜酸乳桿菌低中高劑量組和美沙拉嗪干預(yù)后，小鼠DAI積分及組織病理學(xué)積分較模型組有明顯下降(6.20±2.64，5.00±1.21，5.72±2.63，5.81±1.32 VS7.81±1.02：4.25±2.05，2.56±1.81，2.20±1.12，3.10±2.60 VS5.80±2.94，P<0.05)。
　　 結(jié)論：嗜酸乳桿菌可明顯改善小鼠結(jié)腸組織損傷，其中以高濃度級(jí)嗜酸乳酸桿菌干預(yù)組(1×108CFU/mL)小鼠

4、結(jié)腸炎癥狀緩解最明顯。
　　 目的：針對(duì)腸道菌群生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，采用PCR-SSCP的方法獲得腸道菌群圖譜，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法獲得常見菌群的變化。比較模型組和正常組小鼠的腸道菌群的圖譜變化，分析小鼠腸道微生物多樣性的總體變化和可培養(yǎng)細(xì)菌菌群的變化，為腸道菌群結(jié)構(gòu)解析提供有效手段。
　　 方法：運(yùn)用平板計(jì)數(shù)和基于細(xì)菌16sRNA的PCR-SSCP技術(shù)分析。20只Balb/c小鼠隨機(jī)分為2組，正常組和模型組各10只，模型組

5、每天給與2.5％DSS自由飲用，造成急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，在第7天乙醚麻醉狀態(tài)下處死小鼠，分離結(jié)腸，提取細(xì)菌組DNA進(jìn)行PCR-SSCP分析，針對(duì)優(yōu)勢(shì)條帶回收克隆測(cè)序，初步確定腸道中差異明顯的微生物細(xì)菌種類。并留取部分遠(yuǎn)端結(jié)腸進(jìn)行菌群定植數(shù)量分析。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠與正常小鼠相比，腸道菌群中腸球菌和腸桿菌數(shù)量增多，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯減少。兩組研究對(duì)象的腸道菌叢存在整體差異。SSCP指紋圖譜分析顯示，實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸

6、炎小鼠細(xì)菌微生物區(qū)系的多樣性明顯減少。正常組10個(gè)樣本主帶分布非常一致，均出現(xiàn)在約0.6-0.7 kb處，而模型組主帶位置無統(tǒng)一趨勢(shì)。測(cè)序結(jié)果表明模型組與正常小鼠菌群比較主要是不可培養(yǎng)細(xì)菌的差異。給予嗜酸乳桿菌干預(yù)后可以調(diào)節(jié)遠(yuǎn)端結(jié)腸中腸道菌群的組成，雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量增加，金黃色葡萄球菌數(shù)目減少，總需氧菌、擬桿菌無明顯變化。其中以嗜酸乳桿菌1×108CFU/ml濃度級(jí)組腸道菌群變化最明顯，干預(yù)效果最佳。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)性

7、結(jié)腸炎小鼠腸道菌群分析提示存在菌群失調(diào)，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量減少，金黃色葡萄球菌和總需氧菌明顯增多。腸道菌群多樣性減少，腸道優(yōu)勢(shì)菌群種類少，細(xì)菌種群發(fā)生變化，與正常小鼠相比較主要是不可培養(yǎng)細(xì)菌的差異。平板培養(yǎng)結(jié)果表明，給予不同濃度嗜酸乳桿菌干預(yù)后，可以調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，總?cè)樗釛U菌和雙歧桿菌數(shù)目增加，金黃色葡萄球菌數(shù)目明顯減少，總需氧菌數(shù)目無明顯變化；其中以嗜酸乳桿菌1×108CFU/ml濃度級(jí)組有療效最佳。
　　 目的：探討

8、不同濃度的嗜酸乳酸桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型鼠起治療作用的免疫學(xué)機(jī)制。研究嗜酸性乳酸桿菌對(duì)與IBD發(fā)病密切相關(guān)的Th1/Th2免疫軸相關(guān)IL-12/STAT4/T-bet、IFN-γ/STAT1/T-bet、IL-4/GATA3信號(hào)途徑中的主要相關(guān)細(xì)胞因子和信號(hào)因子的影響，為進(jìn)一步探索嗜酸乳酸桿菌治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎機(jī)制以及用量提供幫助。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組、模型建立及給藥方案與第一章相同，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物留取各組結(jié)腸標(biāo)本，

9、RT-PCR方法檢測(cè)小鼠結(jié)腸黏膜中細(xì)胞因子IL-12、IL-4、IFN-γ及信號(hào)因子T-bet、STAT1、STAT4和GATA3的表達(dá)，western blotting和免疫組化檢測(cè)T-bet在結(jié)腸組織的表達(dá)量及表達(dá)部位。
　　 結(jié)果：嗜酸乳桿菌低中高劑量組及美沙拉嗪干預(yù)后在細(xì)胞因子水平，嗜酸乳桿菌可明顯降低IFN-γ、IL-12的表達(dá)(0.79±0.21，0.68±0.01，0.624-0.09，0.77±0.12 VS0.

10、76±0.03，P<0.05；0.36±0.02，0.37±0.04，0.35±0.13，0.35±0.05 VS0.52±0.02，P<0.05)，增加IL-4(0.78±0.11，0.75±0.03，0.82±0.06，0.81±0.12 VS0.60±0.04，P<0.05)的表達(dá)。其中又以嗜酸乳桿菌高劑量組效果最佳(0.62±0.09 VS0.76±0.03；0.35±0.13 VS0.52±0.02，P<0.05；0.82±0

11、.06 VS0.60±0.04，P<0.05)。
　　 嗜酸乳桿菌低中高劑量組及美沙拉嗪干預(yù)后在核酸水平轉(zhuǎn)錄因子STAT1、T-bet、STAT4的表達(dá)較模型組降低(0.59±0.05，0.55±0.04，0.54±0.06，0.45±0.04 VS0.76±0.05；0.28±0.12，0.27±0.03，0.23±0.04 VS0.41±0.01， P<0.05；0.36±0.02VS0.41±0.01，P>0.05；0.8

12、0±0.03，0.77±0.02，0.72±0.15，0.76±0.14 VS0.94±0.21，P<0.05)，GATA3的表達(dá)升高(0.78±0.25，0.75±0.23，0.82±0.16，0.81±0.09 VS0.60±0.23，P<0.05)，但仍低于正常組(VS0.88±0.19，P>0.05)。而T-bet的蛋白表達(dá)水平和免疫組織化學(xué)表達(dá)都與mRNA表達(dá)水平有相同的趨勢(shì)，較模型組降低(0.27±0.04，0.23±0.0

13、2，0.18±0.04，0.27±0.11 VS0.30±0.04；0.263±0.045，0.234±0.015，0.114±0.025，0.252±0.024 VS0.322±0.064，P<0.05)。其中又以嗜酸乳桿菌高劑量組干預(yù)效果最佳(0.18±0.04VS0.30±0.04，0.114±0.025 VS0.322±0.064，P<0.05)。
　　 結(jié)論：嗜酸乳酸桿菌能有效改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的黏膜炎癥，其部分作用機(jī)制