刀豆蛋白致小鼠免疫性肝損傷MAPEG家族表達(dá)譜及環(huán)孢素調(diào)控.pdf

1、肝臟損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及眾多炎癥介質(zhì)和致病因素。在許多肝病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都涉及了病理性免疫反應(yīng)，而多年來(lái)所應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)肝損害模型(如細(xì)菌脂多糖、D-氨基半乳糖所介導(dǎo)的肝損害)，尚不能很好地反映這一病理特點(diǎn)，因此探索免疫性肝損傷代表性較好的病理模型，無(wú)論對(duì)病理過(guò)程理解還是確認(rèn)藥物靶標(biāo)均具有重要意義。1992年，Tiegs應(yīng)用刀豆蛋白(Concanavalin A,ConA)誘發(fā)小鼠特異性肝損傷，被證實(shí)是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性肝損

2、害，因而被廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞損害的細(xì)胞與分子生物學(xué)機(jī)制以及藥物篩選的研究。 在對(duì)肝臟損傷機(jī)理的深入研究中。發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝產(chǎn)物作為一類具有重要生物活性的脂類前體物質(zhì)，在調(diào)節(jié)肝臟生理和病理過(guò)程中起著重要作用。并且，隨著花生四烯酸代謝通路中各種相關(guān)酶的發(fā)現(xiàn)，尤其是涉及谷胱甘肽與類花生酸代謝相關(guān)的膜結(jié)合蛋白超家族(membrane associated proteins cicosaaoid andglutathione metabo

3、lism,MAPEG superfamily)成員結(jié)構(gòu)與功能確定，花生四烯酸代謝調(diào)控及其炎性終產(chǎn)物與各種肝損傷間相關(guān)研究已引起關(guān)注，但是與免疫性肝損傷問(wèn)的關(guān)聯(lián)性仍遠(yuǎn)未闡明。因此，本研究采用ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷，觀察了花生四烯酸代謝通路中相關(guān)代謝酶MAPEG家族在免疫性肝損傷中的表達(dá)，并進(jìn)一步研究了其與細(xì)胞因子和：MAPK信號(hào)通路之間的聯(lián)系。此外，尚應(yīng)用免疫抑制劑環(huán)孢素(eyelosporin A CsA)預(yù)給藥，特異性抑制ConA造成

4、的肝損傷，并從產(chǎn)物和蛋白水平探討了白三烯通路是否涉及了免疫抑制劑對(duì)于免疫性肝損傷的保護(hù)過(guò)程。 第一部分刀豆蛋白致小鼠肝損傷中MAPEG家族表達(dá)譜與花生四烯酸代謝目的：研究刀豆蛋白(ConA)誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷中花生四烯酸終端產(chǎn)物PGE2和eysLTs的變化，及其代謝通路中MAPEG家族成員表達(dá)譜。 方法：雄性Balb/c小鼠，體重20±2g，隨機(jī)分為5組，每組6只。除陰性對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水外，其他均尾靜脈注射Co

5、nA(20 mg/kg)造模，分別在造模后1，2，6，8 h處死動(dòng)物并收集生物樣本。以血清ALT、AST和HE染色組織病理改變作為肝損傷指標(biāo)。同時(shí)以ELISA法檢測(cè)肝臟cysLTs含量，及其血清相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ：RIA法檢測(cè)肝臟PGE2含量。RT-PCR法檢測(cè)MAPEG家族mPGES，mGST2，mGST3和LTC4S的mRNA表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)MGST2的表達(dá)，Westem blot法檢測(cè)mPGES，mGST3和T

6、C4s及MAPK信號(hào)通路的表達(dá)情況。結(jié)果：ALT、AST和HE病理結(jié)果顯示尾靜脈注射ConA后2h即出現(xiàn)肝損傷,之后損傷程度加深，8 h達(dá)到高峰；ConA損傷早期，肝臟cysLTs含量顯著上升，隨后緩慢下降，而PGE2變化不顯著；基因和蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)mPGES變化不大，而LTC4S，mGST2和mGST3的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)；其他MAPEG家族相關(guān)成員中，5-LO、FLAP和cysLTlR蛋白表達(dá)在2～6 h達(dá)到高峰，

7、8 h后恢復(fù)至正常水平；另外，Con A肝損傷中的兩個(gè)最重要的細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ均在Con A肝損傷的早期呈一過(guò)性升高，而MAPK通路中的P-ERK、p-p38和p-JNK等變化也主要出現(xiàn)在肝損傷早期。 第二部分環(huán)孢素保護(hù)小鼠刀豆蛋白肝損傷MAPEG家族表達(dá)改變及其產(chǎn)物cysLTs含量變化目的：探討環(huán)孢素(CsA)保護(hù)小鼠免疫性肝損傷過(guò)程中，是否涉及了白三烯通路改變，及其對(duì)MAPEG家族表達(dá)的影響。 方法：雄

8、性Balb/c小鼠隨機(jī)分為5組，陰性對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水；尾靜脈注射Con A(20 mg/kg)2 h、8 h制備小鼠免疫性肝損傷早、晚期模型；另設(shè)造模前15 h和1 h兩次尾靜脈注射CsA(100 mg/kg)，之后分別注射生理鹽水和Con A(20mg/kg)，2h和8h后處死，為CsA單用組和CsA/ConA組。血清ALT、AST和HE染色組織病理改變作為肝損傷指標(biāo)，ELISA法檢測(cè)肝臟cysLTs含量，Westem blo

9、t法檢測(cè)MAPEG家族變化。 結(jié)果：CsA預(yù)給藥有效改善了Con A引起的肝臟損傷，使血清ALT、AST顯著下降,并抑制cysLTs表達(dá)增加；CsA預(yù)給藥尚能抑制ConA引起的mGST3和5-LO表達(dá)升高，但對(duì)LTC4S，F(xiàn)LAP和cysLT1R表達(dá)升高的抑制不明顯。 全文結(jié)論： l、ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷過(guò)程，伴有cysLTs表達(dá)增加，F(xiàn)LAP、LTC4S、mGST2和mGST3基因/蛋白表達(dá)上調(diào)，而對(duì)mPGE

10、S基因/蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響;CsA預(yù)給藥可有效抑制肝損傷，并減少cysLTs的表達(dá)增加，降低mGST3的表達(dá)上調(diào)，但對(duì)FLAP和LTC4S表達(dá)的影響不大。 2、ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷過(guò)程增強(qiáng)了5-LO和cysLTlR的表達(dá)，而CsA預(yù)給藥可降低ConA引起的5-LO表達(dá)升高，但對(duì)cysLT1R表達(dá)升高的抑制不明顯。 3、ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷過(guò)程中，MAPK通路率先激活，介導(dǎo)了兩大細(xì)胞因子TNFα、IFNγ的表達(dá)增加，推