三氯乙烯致敏小鼠免疫性肝損傷過(guò)程中補(bǔ)體活化產(chǎn)物對(duì)Th1-Th2細(xì)胞平衡調(diào)控研究.pdf

1、研究背景：
　　三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)作為高分子化合物的常用原料被廣泛應(yīng)用于玩具、五金、電子等行業(yè),主要用于線(xiàn)路板清洗、金屬器械表面去污、油脂和石蠟萃取等。職業(yè)接觸工人長(zhǎng)時(shí)間低濃度接觸TCE可導(dǎo)致職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎（Occupational Dermatitis Medicamentosa-like of Trichloroethylene,ODMLT),臨床資料顯示嚴(yán)重的肝損傷是ODMLT患

2、者的主要致死原因之一,但是這種伴隨的免疫性肝損傷用以往的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)并不能完全解釋?，F(xiàn)有報(bào)道發(fā)現(xiàn),補(bǔ)體激活及其激活產(chǎn)物在ODMLT患者肝損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在TCE致敏豚鼠和BALB/c小鼠中,存在大量的C3a、C5a和C5b-9的沉積,證實(shí)了補(bǔ)體激活及其激活產(chǎn)物在TCE致敏動(dòng)物過(guò)程中確實(shí)發(fā)揮了重要作用,本研究擬在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討補(bǔ)體激活產(chǎn)物在TCE致敏動(dòng)物過(guò)程中的具體機(jī)制。
　　研究

3、目的：
　　本研究通過(guò)建立TCE致敏BALB/c小鼠模型,采用腹腔注射C3aR受體阻斷劑,特異性阻斷C3a和C3aR的結(jié)合,研究TCE致免疫性肝損傷小鼠模型中C3a及其受體對(duì)Th1/Th2細(xì)胞平衡的影響。
　　研究方法：
　　選取6～8 w SPF級(jí)健康雌性BALB/c小鼠,經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、TCE處理組和C3aRA預(yù)處理組,根據(jù)豚鼠最大值試驗(yàn)和本課題組已發(fā)表的文章,建立TCE致敏BA

4、LB/c小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?根據(jù)皮膚致敏情況將TCE處理組分為T(mén)CE致敏組和TCE未致敏組,C3aRA預(yù)處理組分為C3aRA預(yù)處理TCE致敏組(阻斷致敏組)和C3aRA預(yù)處理TCE未致敏組(阻斷未致敏組);采用HE染色觀察不同組別小鼠肝臟病理改變,生化檢測(cè)ALT和AST反映小鼠肝臟功能變化,采用免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測(cè)C3aRA在本致敏模型中的作用,采用免疫組化的方法檢測(cè)各組中C3a和C3aR的表達(dá)情況,采用直接免疫熒光法檢測(cè)補(bǔ)體激活末端產(chǎn)物C

5、5b-9的表達(dá),分別采用流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定小鼠脾臟和血清中IFN-γ和IL-4的表達(dá)水平,利用SPSS軟件包,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠致敏率
　　65只 TCE處理組實(shí)驗(yàn)小鼠共有24只發(fā)生明顯的水腫和紅斑,致敏率為36.9％;C3aRA預(yù)處理組共有62只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,其中32只發(fā)生明顯皮膚反應(yīng),判為阻斷致敏組,致敏率為51.6%,本實(shí)驗(yàn)小鼠總體致敏率為44.1%。
　　2.肝臟

6、病理學(xué)檢查結(jié)果
　　HE結(jié)果顯示,TCE致敏組中出現(xiàn)大量的肝細(xì)胞變性、壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn),且相應(yīng)時(shí)點(diǎn)阻斷致敏組的這種情況表現(xiàn)更為明顯和嚴(yán)重;空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、TCE未致敏組和阻斷未致敏組肝細(xì)胞形態(tài)正常,未見(jiàn)明顯改變。
　　3.小鼠肝功能檢測(cè)結(jié)果
　　對(duì)小鼠肝功能主要指標(biāo)ALT和AST進(jìn)行生化檢測(cè),結(jié)果顯示:溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);TCE致敏24h組、TCE致敏48h組、TCE致

7、敏72h組ALT和AST的表達(dá)均高于相應(yīng)未致敏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);阻斷致敏組中ALT的表達(dá)水平與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)TCE致敏組相比無(wú)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);但是,阻斷致敏48h組和阻斷致敏72h組中AST的表達(dá)水平與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)TCE致敏組相比顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.肝臟組織中C3a與其受體C3aR結(jié)合及阻斷檢測(cè)
　　免疫熒光雙標(biāo)法結(jié)果顯示,TCE致敏組中C3a與其受體C

8、3aR發(fā)生特異性結(jié)合,但是這種特異性結(jié)合在阻斷致敏組中被有效阻斷,提示SB290157在本動(dòng)物模型中確實(shí)是一種特異性的阻斷劑,為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。
　　5.肝臟組織中C3a與其受體C3aR的表達(dá)情況
　　溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏組中 C3a和C3aR的表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);TCE致敏組中C3a和C3aR的表達(dá)均高于相應(yīng)TCE未致敏組,

9、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);阻斷致敏組中C3a的表達(dá)與其在TCE致敏組中的表達(dá)一致,但是阻斷致敏24h組、阻斷致敏48h組、阻斷致敏72h組與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)TCE致敏組相比,C3aR的表達(dá)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　6.肝臟組織中C5b-9的沉積情況
　　應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)小鼠肝臟組織中 C5b-9的沉積情況,結(jié)果顯示:在TCE致敏組和阻斷致敏組中均有大量沉積,且均在72h沉積量最多,在兩組間的沉積未

10、見(jiàn)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　7.脾臟組織中IFN-γ和IL-4的表達(dá)情況
　　溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);IFN-γ在TCE致敏組和阻斷致敏組中的表達(dá)基本一致,兩組間未見(jiàn)明顯改變,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),TCE致敏組和阻斷致敏組均高于溶劑對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),不同時(shí)點(diǎn) TCE致敏組和阻斷致敏組均高于相應(yīng)未致敏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

11、05);TCE致敏組中IL-4的表達(dá)水平明顯高于溶劑對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),不同時(shí)點(diǎn)TCE致敏組中IL-4的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的TCE未致敏組,但是,阻斷致敏組中IL-4的表達(dá)明顯下調(diào),阻斷致敏24h組、阻斷致敏48h組、阻斷致敏72h組顯著低于相應(yīng)的TCE致敏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　8.血清中IFN-γ和IL-4的表達(dá)情況
　　溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

12、;TCE致敏組中IFN-γ和IL-4的表達(dá)水平均高于溶劑對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);不同時(shí)點(diǎn)TCE致敏組中IFN-γ和IL-4的表達(dá)水平均高于相應(yīng)的未致敏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);阻斷致敏組中 IFN-γ的表達(dá)情況與 TCE致敏組基本一致,兩組之間未見(jiàn)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);阻斷致敏組中IL-4的表達(dá)水平明顯低于溶劑對(duì)照組,阻斷致敏48h組和阻斷致敏72h組中IL-4的表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的