PAK1在大腸癌演進和轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、背景與目的 大腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是常見的惡性腫瘤，全球每年新增病例近 1000000例，492000例死亡。隨著經(jīng)濟的進步，生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國大腸癌每年發(fā)病率也快速遞增，特別是大城市上升趨勢更為顯著。大腸癌男女發(fā)病率等同，在40歲以后發(fā)病危險度隨著年齡增加而遞增；資料顯示我國大腸癌男性發(fā)病率約為16.2/100000，女性約為14.5/100000，大腸癌已經(jīng)成為我國致死性腫瘤中

2、最常見的死亡原因之一。然而，大腸癌的治療效果并不理想，在所有的病人中約有半數(shù)患者治療失敗。大腸癌傳統(tǒng)治療方法，即外科手術(shù)治療、放射治療和化學藥物治療方法的不斷發(fā)展和完善，在延長患者生存期和提高患者生存質(zhì)量方面取得了長足的進步；但是手術(shù)和放療是局部治療，難以控制腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，化療藥物往往缺乏組織選擇性和特異性，對骨髓等正常人體重要器官和組織產(chǎn)生嚴重的毒副作用，在過去幾十年，大腸癌的五年生存率一直徘徊在40～50％左右。因此，探尋大腸上

3、皮細胞癌變，演化和轉(zhuǎn)移的機制，特別是尋找早期腫瘤標志物，以期早期發(fā)現(xiàn)和干預大腸癌的生物學進程，對大腸癌的治療具有重要的意義。 p21-activated kinase-1(PAKl)即p21小GTP酶活化激酶1，是第一個被克隆和驗證的的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸化激酶家族成員。PAK是分子量為21KD、Rho家族的小GTP酶(small GTPases)，即Cdc42和Rac的下游效應(yīng)分子。在分子結(jié)構(gòu)上，PAK N-末端為激酶的調(diào)

4、節(jié)區(qū)，C-末端為激酶的底物結(jié)合區(qū)，具有激酶活性。PAK1-3構(gòu)成第一組PAK，分子量為62-64 KD，其激活需要Cdc42和Rac，除調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、正常的細胞生長，分化和凋亡外，PAK家族成員還在人類疾病中起重要作用。PAK1是PAK家族中與人類腫瘤關(guān)系密切的成員，其在細胞骨架修復、延長正常細胞壽命和正向調(diào)節(jié)一些正常生理代謝等方面都起重要作用。PAKl只在腦、肌肉和脾臟正常組織表達，其他組織表達很少，但在很多人類腫瘤細胞都高表達PAK

5、l，尤其是在乳腺癌和卵巢癌細胞中PAKl的表達遠高于其它腫瘤細胞，而且PAKl表達與乳腺癌和卵巢癌細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。但PAKl在大腸癌的發(fā)生發(fā)展、演化和轉(zhuǎn)移中的作用機制尚未明確，因此本課題在系統(tǒng)地檢測PAKl在大腸癌旁正常組織一息肉一腺瘤一原發(fā)性大腸癌組織一大腸癌轉(zhuǎn)移癌瘤組織中的表達差異和分布特點基礎(chǔ)上，同時構(gòu)建PAKl真核表達載體和PAKl shRNA真核表達載體，轉(zhuǎn)染大腸癌SW480細胞，觀察上調(diào)和下調(diào)大腸癌細胞PAKl

6、表達后對大腸癌細胞增殖、凋亡，細胞粘附、運動、侵襲和致瘤等表型的改變，以期深入了解PAKl在大腸癌細胞演化和轉(zhuǎn)移中的作用和機制，并探討PAKl作為大腸癌轉(zhuǎn)移標志和作為潛在治療靶點的可能性。 材料與方法 一、PAKl在良、惡性大腸病變中的表達及其臨床意義用免疫組織化學S-P法檢測PAKl在大腸癌癌旁正常粘膜、大腸息肉、大腸良性腺瘤、大腸癌和大腸癌轉(zhuǎn)移瘤組織中的表達，并分析PAKl表達與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。 二

7、、PAKl對大腸癌細胞表型的影響為檢測PAKl對大腸癌細胞增殖、粘附、移動和侵襲等表型的影響，利用基因重組技術(shù)分別構(gòu)建PAKl真核表達載體和PAKl shRNA真核表達載體(RNA interference,RNAi)，并以大腸癌細胞SW480作為模型，轉(zhuǎn)染重組載體后觀測對大腸癌SW480細胞表型的影響，并分析PAKl在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用及其可能機制。 1、PAKl真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照Genbank上公布的PA

8、Kl mRNA序列(NM 002576)，在其編碼區(qū)(CDS)設(shè)計兩端帶有EcoRI和BamH I酶切位點的引物，利用聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴增PAKl CDS區(qū)，EcoRI和BamH I雙酶切純化的PCR產(chǎn)物和真核表達載體pEGFP/C1，T<,4>連接酶連接酶切純化后的PCR產(chǎn)物和酶切純化后的pEGFP/C1，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，挑單菌落培養(yǎng)擴增，提取重組質(zhì)粒后行EcoRI

9、和BamH I雙酶切鑒定，選擇插入片段正確的克隆測序鑒定。 2、PAKl shRNA重組載體的構(gòu)建根據(jù)siRNA設(shè)計的原則，在PAKl mRNA(NM 002576)CDS設(shè)計三對siRNA核苷酸序列，并設(shè)計一對非相關(guān)核苷酸序列作為對照，經(jīng)Genbank在線BLAST確定確定與其它人類基因無高度同源后，分布在所設(shè)計的siRNA兩端分別加上帶有BamH I和EcoRI酶切位點的 shRNAs(shott hairpin RNAs)

10、單鏈送公司合成，配對單鏈核苷酸退火復性合成雙鏈，按常規(guī)操作把shRNA序列克隆到pRNAT-U6.1/Neo載體中，重組質(zhì)粒酶切和測序鑒定。 3、轉(zhuǎn)染細胞和建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆采用Invintrogen公司的Lipofectamine 2000<'TM>脂質(zhì)體進行細胞轉(zhuǎn)染。細胞轉(zhuǎn)染48h后用分別用80μg/ml G418篩選陽性細胞克隆，挑取單克隆細胞擴增培養(yǎng)。 4、PAKl表達調(diào)控效應(yīng)檢測逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)fReve

11、rse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫印跡、免疫細胞化學與激光共聚焦顯微鏡檢測PAKl mRNA和蛋白質(zhì)水平表達改變。 5、細胞增殖與凋亡MTT法檢測PAKl對大腸癌細胞SW480增殖的影響；采用DNA片段法檢測PAKl對5-Fu誘導的細胞凋亡的影響。 6、細胞基質(zhì)粘附實驗參照文獻的方法研究PAKl對大腸癌細胞SW480粘附的影響。 7、單層細

12、胞劃痕愈傷實驗分析單層細胞劃痕愈傷實驗分析PAKl對大腸癌細胞移行的影響，參照文獻操作。 8、侵襲實驗觀察改變PAKl表達對大腸癌細胞侵襲能力的影響。 9、軟瓊脂糖集落形成實驗觀察RNAi沉默PAKl表達對SW480細胞錨著獨立性生長的影響。 10．明膠酶譜實驗觀測PAKl對SW480細胞基質(zhì)金屬蛋白分泌和活性的影響。 11、裸鼠成瘤實驗觀察PAKl表達對SW480細胞裸鼠成瘤的影響，包括成瘤瘤體大小、侵

13、襲轉(zhuǎn)移部位差異。 三、統(tǒng)計學分析所得數(shù)據(jù)用SPSSl2.0 for Windows軟件，免疫組織化學采用等級資料多個獨立樣本和兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗；其它數(shù)據(jù)行單向方差分析(One-Way ANOVA)，組間多重比較用LSD方法進行分析，以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，以P≤0.05為有顯著性差異。 結(jié)果 1、PAKl在良、惡性大腸病變中的表達及其臨床意義免疫組織化學檢測結(jié)果表明PAKl主要在細胞胞漿表達，

14、胞核偶有少量表達，而在大腸上皮細胞外基質(zhì)中基本不表達。 2．PAKl shRNA真核表達載體經(jīng)酶切和測序證實插入序列與設(shè)計序列完全一致； 3、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480經(jīng)G418抗性篩選得到穩(wěn)定細胞克隆株； 4、與對照細胞比較，RT-PCR和Western blotting從mRNA和蛋白水平證實SW480內(nèi)源性PAKl被PAKl shRNA抑制； 5、選取PAKl shRNA中一個克隆細胞株用作后續(xù)實驗，并

15、把其細胞克隆命名為 SW480<'shRNAl>，非相關(guān)序列細胞克隆命名為SW480<'shRNA-N>;PAKl真核載體細胞克隆株命名為Sw480<'PAKl>，pEGFP/C1質(zhì)粒對照細胞克隆命名為SW480<'svector>； 6、細胞增殖實驗顯示，在各組細胞孵育24h后，各組細胞間增殖有顯著性差異； 8、細胞-基質(zhì)粘附實驗結(jié)果顯示各組細胞之間粘附細胞明顯不同，8W480<'shRNAl>細胞顯著減少，與SW48

16、0細胞相比(P=0.015)和與SW480<'shRNA-N>相比較P=0.018)，而SW480細胞與SW480<'shRNA-N>細胞之間比較無顯著性差異；SW480<'PAKl>與SW480相比(P=0.004)和與SW480<'vector>相比(P=0.004)，細胞粘附顯著增加。 9通過軟瓊脂糖克隆形成實驗可以觀察細胞錨定獨立性生長的能力，從而反映細胞的惡性程度。 結(jié)論 1、免疫組織化學檢測顯示PAK

17、l表達從腺瘤到腫瘤、從原發(fā)大腸癌到轉(zhuǎn)移大腸癌依次增加，提示PAKl在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。 2、上調(diào)PAKl表達可以促進大腸癌細胞SW480增殖，下調(diào)PAKl表達則可以抑制大腸癌細胞SW480的增殖； 3、PAKl可以增強大腸癌細胞的異質(zhì)粘附，下調(diào)PAKl表達則抑制SW480細胞的異質(zhì)粘附； 4、PAKl增強大腸癌細胞的非錨定式依賴式生長，下調(diào)PAKl表達則抑制大腸癌細胞的集落形成能力； 5