Pak1對胃癌細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的： 近年來胃癌的發(fā)病率有所降低，但仍是世界上第四大惡性腫瘤，并且死亡率高居第二。盡管對胃癌患者的診斷和治療有了長足的進(jìn)步，但進(jìn)展期胃癌的預(yù)后效果依然很差。2000年大約880000人被診斷患有胃癌，同時將近650000人死于胃癌。在過去的幾年中，已經(jīng)證實(shí)胃癌的發(fā)生發(fā)展是多基因改變的結(jié)果。胃癌中特殊基因的表達(dá)異常在不同的細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，例如細(xì)胞粘附、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、DNA修復(fù)和糖基化改變。更好的

2、了解胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將有利于胃癌診斷、治療和預(yù)防的提高。但是胃癌的基因改變的具體機(jī)制尚不完全清楚。 P21活化激酶1(p21—activated kinase1，Pakl)，作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是小G蛋白Rho家族Cdc42和Racl的主要下游靶蛋白，被活化后具有激酶活性，參與其信號通路，在細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等方面起重要作用。Pakl除了能被小GTPase活化外，還能被其它蛋白活化參

3、與其信號通路。Janus激酶2(Janus kinase2，JAK2)和磷脂酰肌醇—3—激酶(PI3—kinase，PI3K)可以通過磷酸化的方式使Pakl活化，而蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)可以通過磷酸化使Pakl失活。Pakl還可以通過幾個磷酸化位點(diǎn)發(fā)生自我磷酸化，其中包括位于自我抑制環(huán)的Thr423。以前的研究結(jié)果表明Racl與胃癌的TNM分期正相關(guān)，下調(diào)的RhoA表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長。但是關(guān)于Pa

4、kl和胃癌的關(guān)系研究很少。 方法： 一、Pakl影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。 1、western blot和免疫組化檢測Pakl在胃癌組織中的表達(dá)情況。 2、Pakl激酶分析檢測BGC823、MGC803、SGC7901、MKN1、MKN45細(xì)胞中Pakl的活性情況，同時檢測這些細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲能力。 3、將化學(xué)合成的PaklsiRNA轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞后，進(jìn)行western blot檢測、

5、MTT增殖分析、運(yùn)動和侵襲能力分析。 4、構(gòu)建Pakl穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞系后，繪制生長曲線、非錨定依賴生長分析，并且檢測運(yùn)動和侵襲能力。 5、將野生型BGC823細(xì)胞、對照穩(wěn)定細(xì)胞系、Pakl下調(diào)細(xì)胞系(17號克隆)通過皮下、腹腔和尾靜脈分別注射到三組裸鼠體內(nèi)。通過動物實(shí)驗(yàn)檢測Pakl在體內(nèi)的增殖和轉(zhuǎn)移能力。 二、Pakl影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。 1、Pakl在BGC823細(xì)胞中調(diào)節(jié)Cyclin

6、B1的表達(dá)。 (1)免疫組化檢測對照穩(wěn)定細(xì)胞系、17號克隆在裸鼠皮下形成的移植瘤。 (2)Western blot檢測Pakl穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞系中Cyclin B1的表達(dá)。 (3)將Pakl激活型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞后western blot檢測Cyclin B1蛋白的表達(dá)。 (4)Northern blot檢測Pakl穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞系中Cyclin B1 mRNA的表達(dá)。 2、Pakl在BGC82

7、3細(xì)胞中調(diào)節(jié)Cyclin B1啟動子的活性。 (1)瞬時轉(zhuǎn)染Cyclin B1熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒到Pakl穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞系中，檢測Cyclin B1啟動子的活性。 (2)瞬時轉(zhuǎn)染GST-PID到BGC823細(xì)胞中，檢測Cyclin B1啟動子的活性。 (3)瞬時轉(zhuǎn)染野生型Pakl和激活型Pakl質(zhì)粒到BGC823細(xì)胞中，檢測Cyclin B1啟動子的活性。 3、AO/EB雙重染色法檢測Pakl是否促進(jìn)胃癌BG

8、C823細(xì)胞誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞凋亡。 4、定量PCR檢測miRNA—100在照穩(wěn)定細(xì)胞系、17號克隆中的表達(dá)情況。 5、轉(zhuǎn)染miRNA—100的成熟體和抑制子后，檢測BGC823細(xì)胞的增殖、運(yùn)動和侵襲能力。 結(jié)果： 一、Pakl影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。 1、Pakl的蛋白表達(dá)在Ⅳ期胃癌組織中明顯升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于原發(fā)灶。 2、Pakl活性高的細(xì)胞有更強(qiáng)的運(yùn)動能力和侵襲能力

9、。 3、瞬時下調(diào)Pakl的表達(dá)，抑制BGC823胃癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動、侵襲能力。 4、穩(wěn)定下調(diào)Pakl的表達(dá)，抑制BGC823胃癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動、侵襲能力。 5、穩(wěn)定干涉Pakl的胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤性降低，轉(zhuǎn)移能力減弱。 二、Pakl影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。 1、Pakl在胃癌BGC823細(xì)胞中調(diào)節(jié)Cyclin B1的表達(dá)。 2、Pakl在胃癌BGC823細(xì)胞中調(diào)節(jié)Cy

10、clin B1啟動子的活性。 3、Pakl促進(jìn)胃癌BGC823細(xì)胞誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞凋亡。 4、Pakl在胃癌BGC823細(xì)胞中調(diào)節(jié)miRNA—100的表達(dá)。 5、miRNA—100影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。 結(jié)論： 1、Pakl能夠在體內(nèi)和體外影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。 2、Pakl在胃癌BGC823細(xì)胞中調(diào)節(jié)Cyclin B1的表達(dá)。 3、Pakl促進(jìn)胃癌BGC823