FOXK1與FHL2在大腸癌的增殖、EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移中的相互作用.pdf

1、目的:
　　轉(zhuǎn)錄因子FOXK1作為FOX家族的一個(gè)成員，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。有研究表明，F(xiàn)OXK1的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增值侵襲與轉(zhuǎn)移，影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后。FHL2(Four and a half LIM Protein2)作為癌基因，在胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)HL2蛋白能與多種靶蛋白結(jié)合并調(diào)控靶蛋白的活性，是誘導(dǎo)上皮間質(zhì)

2、轉(zhuǎn)化(EMT)和侵襲的一個(gè)關(guān)鍵的蛋白，在胃腸道腫瘤中高表達(dá)，正常組織中不表達(dá)。目前有研究FOXK1與FHL2在肌源性祖細(xì)胞中的相互作用，但在胃腸道腫瘤中的相互作用機(jī)制研究甚少。本課題主要研究FOXK1與FHL2在結(jié)直腸癌中的相互作用，評(píng)估FOXK1與FHL2的表達(dá)對(duì)結(jié)直腸預(yù)后的影響，為結(jié)直腸癌探索新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　方法:
　　SW480、Caco2、SW620細(xì)胞，F(xiàn)OXK1抗兔單克隆抗體、FHL2抗兔/鼠單克隆抗

3、體，E-cadherin、GAPDH抗兔單克隆抗體、Vimentin、MMP2、MMP9、Snail抗鼠單克隆抗體，抗鼠熒光二抗、抗兔熒光二抗，羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽，EdU試劑盒，結(jié)晶紫。
　　1.收集結(jié)直腸癌組織，用qRT-PCR和免疫組化檢測(cè)并比較FOXK1在結(jié)直腸癌組織與正常組織中的表達(dá)。
　　2.用免疫熒光的方法證實(shí)FOXK1與FHL2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)與定位。
　　3.利用免疫共沉淀驗(yàn)證FOXK1與FHL2

4、間的相互作用，探討兩者的關(guān)系。
　　4.評(píng)估FOXK1和FHL2對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響。
　　87例結(jié)直腸癌組織芯片分別FOXK1和FHL2染色，相關(guān)性分析驗(yàn)證FOXK1與FHL2的相互作用，生存分析評(píng)估其對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響。
　　5.下調(diào)FHL2驗(yàn)證FOXK1與FHL2在結(jié)直腸癌中的相互作用。
　　5.1 建立穩(wěn)定表達(dá)株Vector，及FOXK1，并在此基礎(chǔ)上瞬轉(zhuǎn)FHL2siRNA(FOXK1-FHL2siRN

5、A)。
　　5.2 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)探究下調(diào)FHL2對(duì)FOXK1誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　5.3 觀察三組細(xì)胞形態(tài)變化、羅丹明鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架變化、Western blot檢測(cè)三組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、Snail、MMP2、MMP9的表達(dá)。探究下調(diào)FHL2對(duì)FOXK1誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT的影響。
　　6.收集結(jié)直腸

6、癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的淋巴結(jié)，免疫組化驗(yàn)證FOXK1和FHL2在轉(zhuǎn)移瘤中的表達(dá)。
　　7.建立裸鼠皮下成瘤模型、脾被膜下肝轉(zhuǎn)移模型和尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型，體內(nèi)驗(yàn)證壓低FHL2表達(dá)對(duì)FOXK1誘導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響。
　　結(jié)果:
　　1.FOXK1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于正常組織;
　　2.FOXK1和FHL2在結(jié)直腸癌組織細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān);
　　3.FOXK1與FHL2在結(jié)直腸癌中存在相互協(xié)同作用;