PAK1、HIF-1α在結(jié)直腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、[背景]:
　　 結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)結(jié)直腸癌居癌癥致死因素的第四位。近十年來(lái)，結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。盡管近年來(lái)手術(shù)方式和輔助治療手段不斷發(fā)展，結(jié)直腸癌患者的生存率仍舊不理想。侵襲與轉(zhuǎn)移是影響患者治療效果和導(dǎo)致患者死亡的主要原因。像其他惡性腫瘤一樣，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，從最初的腺瘤息肉到晚期的腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，整個(gè)過(guò)程可以長(zhǎng)達(dá)數(shù)年或數(shù)十年。由于結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展

2、呈現(xiàn)出明顯的階段性特征，因此結(jié)直腸癌一直被視為各種惡性腫瘤中的“模式腫瘤”。結(jié)直腸癌的發(fā)生與細(xì)胞周期、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和侵襲轉(zhuǎn)移等機(jī)制有著密切的關(guān)系，因此，篩選其發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并闡明其相關(guān)分子機(jī)制，尋找理想的用于早期診斷或判斷預(yù)后的結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物，將對(duì)臨床結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)防、治療具有重要意義。近年來(lái)關(guān)于PAK1和HIF-1α在腫瘤組織中的異常表達(dá)逐漸受到重視，其在多種腫瘤中均有異常表達(dá)，且與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對(duì)部分

3、腫瘤的診斷分型及預(yù)后判斷均有一定價(jià)值。但是，PAK1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的分子生物學(xué)機(jī)制和臨床價(jià)值尚未完全明確。
　　 PAK(p21-activatedkinasep21活化激酶)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在人類中它包含六個(gè)家族成員，即PAK1-6，PAK1是第一個(gè)被鑒定出來(lái)并且研究最多的PAK家族成員，PAK1基因定位于人類染色體11q13.5-q14區(qū)。PAK1在細(xì)胞形成、運(yùn)動(dòng)、生存和增殖調(diào)節(jié)過(guò)程中起重要作用

4、;PAK1與細(xì)胞的分裂、凋亡、和基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān);在分子生物學(xué)層面，PAK1在細(xì)胞生命周期的調(diào)控中具有重要作用;在各種復(fù)雜和精確的基因調(diào)控下，PAK1具有依照特定的生理需求集合多種信號(hào)的能力。PAK1在人類癌癥中調(diào)控的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。
　　 結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及細(xì)胞的增殖、變異及細(xì)胞生命周期的調(diào)節(jié)。在結(jié)直腸癌中，KRas和BRaf基因的突變率分別為40％和10％。KRas和BRaf可激活絲裂原活化

5、蛋白激酶(MAPK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)。MAPK和ERK的激活和高表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。KRas可分別激活PI3K（磷脂酰肌醇-3激酶，一種癌基因，其突變和激活具有致癌作用）或AKT-獨(dú)立通道（蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用），在30％上皮癌中PI3K發(fā)生突變，而在22％結(jié)直腸癌中KRas和PI3K均發(fā)生突變。PAK1在結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)展的分子生物學(xué)過(guò)程中具有重要的作

6、用。PAK1是KRas和BRaf的上游調(diào)節(jié)因子，PAK1可通過(guò)KRas和BRaf激活ERK、MAPK通路從而促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變并激活A(yù)KT從而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和生存能力。PAK1的表達(dá)隨著結(jié)直腸癌的進(jìn)展逐漸增高。下調(diào)PAK1的表達(dá)可減弱ERK和AKT的活性，引起細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及活力的下降。同時(shí)抑制ERK和AKT可降低PAK1的表達(dá)進(jìn)而減弱細(xì)胞的活力，而單獨(dú)的抑制ERK或AKT通路將部分的抑制細(xì)胞的遷移、侵襲及存活能力，但對(duì)細(xì)胞的分裂增殖

7、沒(méi)有影響。由于KRas可經(jīng)PI3K-依賴途徑激活PAK1，而突變的KRas和PI3K在結(jié)腸癌中具有重要作用，因此PAK1可能作為一個(gè)匯聚點(diǎn)接收來(lái)自于KRas和PI3K的信號(hào)，從而由ERK和AKT的活化作用促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移。綜上可知，PAK1經(jīng)ERK和AKT依賴途徑刺激結(jié)腸癌細(xì)胞的增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，這確立了PAK1在結(jié)直腸癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)換過(guò)程中的中心位置并闡明了由PAK1調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　 HIF-1(hypo

8、xiainduciblefactor-1缺氧誘導(dǎo)因子-1)是由α和β兩個(gè)亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)和活性受到細(xì)胞內(nèi)氧濃度的嚴(yán)密調(diào)控，O2主要通過(guò)α亞基調(diào)節(jié)HIF-1的活性。HIF-1α是在缺氧條件下普遍存在于人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，是腫瘤進(jìn)展的始動(dòng)因素，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在無(wú)新生血管生成的微小實(shí)體瘤階段，HIF-1α可通過(guò)調(diào)控糖酵解作用來(lái)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)低氧的耐受并為腫瘤細(xì)胞供應(yīng)能量;當(dāng)腫瘤擴(kuò)大致數(shù)毫米時(shí)，HIF

9、-1α又可通過(guò)控制血管的生成來(lái)調(diào)節(jié)氧的運(yùn)輸能力并為腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件。HIF-1α可調(diào)控40余種基因的表達(dá)（如Snail、Slug、Twist、SIP-1等）并在維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、促進(jìn)新生血管的形成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用。而HIF-1α在人類癌癥中調(diào)控的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。
　　 EMT(epithelia-mesenchymaltransition)過(guò)程是指具有細(xì)胞間緊密連接和黏附

10、能力的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有活動(dòng)能力并能在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。EMT是上皮細(xì)胞癌獲得浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力的一個(gè)重要途徑。涉及調(diào)控EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子包括Twist,Snail，Slug，SIP-1等，它們?cè)诎┘?xì)胞中均能抑制E-cadherin（E-鈣粘蛋白，一種重要的腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移抑制劑）的表達(dá)引起E-cadherin的下調(diào)從而誘導(dǎo)EMT過(guò)程的形成。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)部中HIF-1α和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)是相互協(xié)同的，HIF-1α

11、能直接或間接的調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Twist、Snail、Slug、SIP-1)的表達(dá)并能調(diào)節(jié)各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用進(jìn)而促進(jìn)EMT過(guò)程。HIF-1α和Twist均屬于bHLH家族成員并廣泛參與調(diào)控器官生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖分化等過(guò)程。HRE（缺氧反應(yīng)元件）已被證實(shí)在Twist鄰近的啟動(dòng)子上，Yang等研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α能通過(guò)直接與HRE結(jié)合而上調(diào)Twist的表達(dá)并促進(jìn)EMT的形成和腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。HIF-1α可促進(jìn)

12、Snail及SIP1基因的過(guò)表達(dá)，并與EMT過(guò)程的發(fā)生和一系列細(xì)胞改變有著密切聯(lián)系。HIF-1α在缺氧條件下可激活轉(zhuǎn)錄因子SIP1從而阻止POlⅡ（RNA聚合酶-Ⅱ）與E-cadherin上的啟動(dòng)子銜接，導(dǎo)致E-cadherin的表達(dá)降低從而促進(jìn)EMT。賴氨酰氧化酶和賴氨酰氧化酶2已經(jīng)被證實(shí)是HIF-1α的調(diào)節(jié)靶區(qū)并能在低氧環(huán)境中調(diào)節(jié)Snail以誘導(dǎo)EMT過(guò)程的發(fā)生并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。HIF-1α可激活Slug并與MT4-MMP（人膜型基質(zhì)

13、金屬蛋白酶4）鄰近啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合位點(diǎn)相互作用從而激活MT4-MMP的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。綜上可知，在腫瘤微環(huán)境中，HIF-1α的激活是腫瘤發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素，HIF-1α可調(diào)控多種基因參與腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成、上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移，并協(xié)調(diào)這些基因參與人類惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。
　　 [目的]:
　　 結(jié)合PAK1與HIF-1α促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，我們推測(cè)PAK1和HIF-1α可能在結(jié)直

14、腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。通過(guò)檢索，目前尚無(wú)聯(lián)合檢測(cè)PAK1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中表達(dá)的相關(guān)文獻(xiàn)，因此我們分別在mRNA和蛋白層面聯(lián)合檢測(cè)結(jié)直腸癌中PAK1和HIF-1α的表達(dá)情況，研究PAK1和HIF-1α在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的表達(dá)以及分析它們之間的關(guān)系。
　　 [方法]:
　　 1、標(biāo)本來(lái)源:收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬順德第一人民醫(yī)院2011年3月到2011年10月間結(jié)直腸癌手術(shù)切除組織標(biāo)本60例;男36例，女

15、24例，年齡51-82歲（中位66歲）;結(jié)腸癌34例，直腸癌26例;組織學(xué)分級(jí):高分化10例，中分化31例，低分化19例;Dukes分期:A期10例，B期19例，C期19例，D期12例。
　　 2、研究方法:結(jié)直腸癌以蘇木精-伊紅(HE)染色法為判定和入選標(biāo)準(zhǔn)。采用熒光原位雜交(FISH)和免疫組化方法(IHC)分別檢測(cè)60例結(jié)直腸癌患者的正常結(jié)直腸粘膜和結(jié)直腸癌組織中PAK1和HIF-1α表達(dá)的變化;采用FISH結(jié)果分析PAK

16、1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中表達(dá)的變化與結(jié)直腸癌的臨床病理資料之間的關(guān)系;采用IHC結(jié)果分析PAK1和HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性;探討PAK1和HIF-1α在結(jié)直腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用pearsonx2檢驗(yàn)分析PAK1和HIF-1α的表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理參數(shù)之間的聯(lián)系（P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）;用McNemar檢驗(yàn)分析PAK1和HIF-1α在mRNA和蛋白層面其陽(yáng)性表

17、達(dá)率有無(wú)差異(P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法分析PAK1和HIF-1α在蛋白層面表達(dá)的相關(guān)性(P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。
　　 [結(jié)果]
　　 1、PAK1在正常結(jié)直腸粘膜和結(jié)直腸癌中的表達(dá):PAK1-mRNA在60例正常結(jié)直腸粘膜組織中陽(yáng)性表達(dá)率為8.33％(5/60)，在60例結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為70.00％(42/60)，PAK1-mRNA在結(jié)直腸癌組織中和

18、正常結(jié)直腸粘膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=47.881P＜0.001);PAK1-蛋白在60例正常結(jié)直腸粘膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為11.67％(7/60)，在60例結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率76.67％(46/60)，PAK1-蛋白在結(jié)直腸癌組織中和正常結(jié)直腸粘膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=51.400P＜0.001);PAK1-mRNA與PAK1蛋白在結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.682P

19、=0.268)。
　　 2、HIF-1α在正常結(jié)直腸粘膜和結(jié)直腸癌中的表達(dá)特征:HIF-1α-mRNA在60例正常結(jié)直腸粘膜組織中陽(yáng)性表達(dá)率為20.00％(12/60)，在60例結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率73.33％(43/60)，HIF-1α-mRNA在結(jié)直腸癌組織中和正常結(jié)直腸粘膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=32.257P＜0.001);HIF-1α蛋白在60例正常結(jié)直腸粘膜組織中陽(yáng)性表達(dá)率為16.67％(10/

20、60)，在60例結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為78.33％(47/60)，HIF-1α蛋白在結(jié)直腸癌組織中和正常結(jié)直腸粘膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=45.750P＜0.001);HIF-1α-mRNA與HIF-1α蛋白在結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.711P=0.264)。
　　 3、PAK1-mRNA和HIF-1α-mRNA的表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理參數(shù)之間的聯(lián)系:PAK1-mRNA在結(jié)腸癌

21、和直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.564P=0.211);HIF-1α-mRNA在結(jié)腸癌和直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.045P=0.832);PAK1-mRNA在結(jié)直腸癌不同分化程度中的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=2.286P=0.130);HIF-1α-mRNA在結(jié)直腸癌不同分化程度中的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=10.260P=0.003);PAK1-mRNA在Dukes不同分期中的陽(yáng)

22、性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.876P=0.016);HIF-1α-mRNA在Dukes不同分期中的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.705P=0.029);PAK1-mRNA在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.876P=0.015);HIF-1α-mRNA在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.705P=0.030)。
　　 4、PAK1和HIF-1α在結(jié)直

23、腸癌中表達(dá)的相關(guān)性:Spearman等級(jí)相關(guān)分析PAK1和HIF-1α蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.293，P=0.023），PAK1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中表達(dá)的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。
　　 [結(jié)論]:
　　 1、PAK1在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，PAK1-mRNA在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常結(jié)直腸粘膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率;PAK1-mRNA與PAK1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異。

24、>　　 2、HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，HIF-1-mRNA在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常結(jié)直腸粘膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率;HIF-1α-mRNA與HIF-1α蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異。
　　 3、PAK1-mRNA在結(jié)腸癌和直腸癌中的表達(dá)無(wú)顯著差;PAK1在結(jié)直腸癌的分化程度中的表達(dá)無(wú)顯著差異;PAK1的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性;HIF-1α-mRNA在結(jié)腸癌和直腸癌中的表達(dá)