dUTP焦磷酸酶在大腸癌演化中的作用.pdf

1、背景與目的 dUTP焦磷酸酶(deoxyuridinetriphosphatenucleotedohydrolase，dUTPase)是體內(nèi)-種重要的水解酶，基本功能是把dUTP水解成dUMP和焦磷酸(pyrophosphoricacid，PPi)，不但可為DNA的合成提供原料，還可降低細(xì)胞內(nèi)dUTP的濃度以降低DNA突變的頻率，維持細(xì)胞遺傳的穩(wěn)定。dUTPase編碼兩種同工酶：線粒體型DUT-M和細(xì)胞核型DUT-N，DUT-M

2、在非分裂、代謝活躍的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，DUT-N則受細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。dUTPase在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)依賴于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，分化能力高的細(xì)胞dUTPase活性相對水平較高，處于分化后期或不分化的細(xì)胞的dUTPase活性則較低。對大腸癌的研究發(fā)現(xiàn)大腸癌細(xì)胞SW620的dUTPase的活性比HT29高4.4倍，而大腸癌細(xì)胞HT29轉(zhuǎn)染dUTPase基因后活性增加，表現(xiàn)出對FUdR的耐藥性。 材料和方法 1選取四種不同病理組織來源的大腸癌

3、細(xì)胞株LoVo、SW620、SW480和SW1116為研究對象，檢驗這四種細(xì)胞的粘附性以證實它們的生物學(xué)特性差異。應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetranspcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)和蛋白免疫印跡(WesternBlottingWB)從mRNA和蛋白表達(dá)兩個水平檢測dUTPase的差異表達(dá)，顯色反應(yīng)驗證這四種細(xì)胞株中dUTPase的活性差別，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色確定dU

4、TPase在細(xì)胞內(nèi)的定位，并進(jìn)一步證實dUTPase在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異。 2免疫組織化學(xué)檢測不同分期大腸癌和大腸息肉患者的dUTPase表達(dá)，RT-PCR檢測DukesB和C期的大腸癌患者的dUTPasemRNA表達(dá)，探討dUTPase表達(dá)與大腸癌病理學(xué)的特點(diǎn)的關(guān)系。 3針對dUTPase的基因的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)真核轉(zhuǎn)染dUTPase表達(dá)較高的SW620細(xì)胞后，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株

5、，用RT-PCR和WesternBlot檢驗干擾效果，異質(zhì)粘附實驗證實dUTPase表達(dá)下調(diào)后的細(xì)胞粘附性的改變，生長曲線、MTT觀測細(xì)胞增殖的變化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、凋亡的變化，小室法和劃痕法檢測細(xì)胞侵襲力和遷移力改變，并進(jìn)行體內(nèi)動物實驗觀察腫瘤致瘤性、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的差異，來進(jìn)一步分析dUTPase對大腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。 結(jié)果 1、大腸癌細(xì)胞株LoVo、SW620、SW480和SW1116中dUTPa

6、se的差異表達(dá) (1)大腸癌細(xì)胞株LoVo、SW620、SW480和SW1116的粘附性差異 (2)半定量RT-PCR檢測LoVo、SW620、SW480和SW1116的dUTPasemRNA表達(dá)水平 (3)WesternBlotting檢測LoVo、SW620、SW480和SW1116的dUTPase蛋白表達(dá) (4)顯色反應(yīng)檢測LoVo、SW620、SW480和SW1116的dUTPase的活性

7、 (5)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行dUTPase的細(xì)胞內(nèi)定位 2、不同分期大腸癌患者的dUTPase表達(dá) (1)dUTPase在大腸良、惡性病變的表達(dá) 大腸癌癌旁組織粘膜中dUTPase的表達(dá)極少，偶爾在隱窩的基底部有弱陽性細(xì)胞。大腸息肉中dUTPase的表達(dá)呈弱陽性，陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的5％-20％，自絨毛基底至頂端均有分布，有簇狀傾向。大腸癌中dUTPase表達(dá)明顯增高，陽性細(xì)胞不規(guī)則地散亂分布或比較密集地灶性分布

8、，與細(xì)胞總數(shù)的比例為10％-80％。 (2)dUTPase在大腸癌的表達(dá)與臨床病理學(xué)的關(guān)系 進(jìn)一步探討大腸癌組織中dUTPase的表達(dá)與其臨床特點(diǎn)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高分化的大腸癌與低分化的大腸癌相比dUTPase強(qiáng)陽性的表達(dá)率有顯著性差異(P＜0.05)，提示低分化的大腸癌組織中dUTPase表達(dá)更明顯。侵潤深度的不同的大腸癌dUTPase的表達(dá)也有顯著性差異(P＜0.001)，侵潤至漿膜的腫瘤組織中dUTPase的表達(dá)高于侵

9、潤至肌層的大腸癌，提示侵潤程度較深的大腸癌組織中dUTPase表達(dá)更明顯。 (3)不同分期的大腸癌的dUTPasemRNA表達(dá)的差異 無轉(zhuǎn)移的DukesB期大腸癌組織內(nèi)可見dUTPasemRNA的相對較低表達(dá)，dUTPase/β-actin為1.54±0.20。有轉(zhuǎn)移的DukesC期大腸癌組織內(nèi)dUTPasemRNA水平明顯升高，dUTPase/β-actin為2.37±0.17，為無轉(zhuǎn)移大腸腫瘤組織的1.5倍，差異有顯

10、著性(P＜0.01)。提示不同分期的大腸癌組織中的dUTPasemRNA表達(dá)有顯著性差異。 3、RNA沉默dUTPase表達(dá)對SW620細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 (1)成功地構(gòu)建了兩個dUTPase發(fā)夾siRNA的真核表達(dá)載體sidUTPase/pSilenCircle和無關(guān)基因重組質(zhì)粒siFly/pSilenCircle (2)以上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞，并進(jìn)行抗性篩選和干擾效果的鑒定 (3)RN

11、Ai后SW620細(xì)胞生物學(xué)特性的變化 異質(zhì)粘附實驗的粘附細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示三個細(xì)胞株總體粘附性有差異。其中，p-shRNA1-SW620粘附細(xì)胞數(shù)明顯少于SW620(P＜0.001)和p-sifly-SW620(P＜0.001)，后兩組的粘附細(xì)胞數(shù)差別不明顯(P＞0.05)，提示與SW620和p-sifly-SW620相比較，p-shRNA1-SW620的細(xì)胞-基質(zhì)粘附能力顯著降低。生長曲線顯示與SW620和p-sifly-SW6

12、20相比較，p-shRNA1-SW620細(xì)胞的生長速度明顯下降。MTT檢測細(xì)胞活力顯示p-shRNA1-SW620細(xì)胞的吸光值為0.78±0.10，SW620細(xì)胞為1.14±0.17，p-sifly-SW620細(xì)胞為1.07±0.21，p-shRNA1-SW620細(xì)胞與SW620細(xì)胞和p-sifly-SW620細(xì)胞相比P＜0.001，p-sifly-SW620與SW620相比P＞0.05，提示p-shRNA1-SW620細(xì)胞增殖受到一定

13、抑制作用，生長繁殖減慢。 (4)RNAi后細(xì)胞PPARγ和NF-κB表達(dá)的變化 RT-PCR檢測三個細(xì)胞株P(guān)PARγ的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p-shRNA1-SW620的PPARγ與B-actin的相對表達(dá)量(PPARγ/β-actin)與p-sifly-SW620和SW620相比P＜0.01，p-sifly-SW620與SW620相比P＞0.05，提示RNAi沉默dUTPase表達(dá)后p-shRNA1-SW620細(xì)胞內(nèi)PPA

14、RγmRNA的表達(dá)增高。Westernblotting檢測顯示p-shRNA1-SW620細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白水平較SW620細(xì)胞增高，而p-sifly-SW620細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白的表達(dá)量與SW620相比無明顯改變，提示RNAi沉默dUTPase表達(dá)后p-shRNA1-SW620細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)增高。EMSA顯示空白對照組SW620細(xì)胞表現(xiàn)較高的NF-κB活性，p-shRNA1-SW620活性明顯降低，而p-sifly-SW

15、620與SW620相比NF-κB序列結(jié)合活性無明顯變化，提示RNAi沉默dUTPase表達(dá)后p-shRNA1-SW620細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性明顯降低。 結(jié)論 1、四種不同病理組織來源的大腸癌細(xì)胞株LoVo、SW620、SW480和SW1116異質(zhì)粘附實驗證實它們之間有粘附性差異，其中LoVo、SW620的粘附性明顯高于SW480和SW1116。 2、應(yīng)用RT-PCR和WesternBlotting從mRNA和蛋白

16、表達(dá)兩個水平檢測dUTPase的差異表達(dá)，提示dUTPase在SW620和LoVo細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)高于SW480和SW1116細(xì)胞。 3、免疫組織化學(xué)表明大腸癌和大腸息肉的dUTPase陽性產(chǎn)物主要位于胞漿。大腸癌和大腸息肉中的dUTPase表達(dá)率高于癌旁粘膜。大腸癌和息肉的dUTPase表達(dá)強(qiáng)度高于癌旁粘膜，其中，大腸癌又高于大腸息肉。dUTPase的表達(dá)與大腸癌的分化程度、侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。 4、構(gòu)建