肝門(mén)阻斷再灌注后腦皮層興奮性遞質(zhì)改變和肢體缺血預(yù)適應(yīng)的作用.pdf

1、本文擬通過(guò)建立大鼠非轉(zhuǎn)流肝門(mén)阻斷模型模擬無(wú)肝期過(guò)程，研究再灌注后大腦皮層形態(tài)學(xué)、中樞神經(jīng)損傷特異性生化標(biāo)志物、興奮性氨基酸及其特異性受體表達(dá)的改變，從細(xì)胞、蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)和基因水平上探討損害的細(xì)胞內(nèi)、外機(jī)制；同時(shí)應(yīng)用遠(yuǎn)程缺血預(yù)適應(yīng)作為干預(yù)措施研究能否為HPO模型提供腦保護(hù)，以期減少神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。本研究分為三個(gè)部分：一、肝門(mén)阻斷再灌注后中樞和外周S100 β蛋白的差異性改變及意義；二、肝門(mén)阻斷再灌注后腦皮層興奮性氨基酸及NMDA受體mR

2、NA表達(dá)的改變；三、肢體缺血預(yù)適應(yīng)減輕肝門(mén)阻斷再灌注后腦皮層EAAs及NMDA受體表達(dá)的增加。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。健康雄性Wistar大鼠，體重200～250g。 2、主要試劑及藥品。S100β蛋白ELISA試劑盒(大連泛邦生化技術(shù)公司提供產(chǎn)品)；Glu和Asp標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA公司)；總RNA提取試劑盒(天澤基因工程公司提供)；TaKaRa PCR試劑盒及DNAMarker

3、等(大連寶生物公司提供)；NMDAR1、NMDAR2B、β-actin引物(北京三博遠(yuǎn)生志生物技術(shù)公司合成)；MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠NMDAR2B-抗(美國(guó)Biosouse公司)。 3、主要儀器。 Datex多功能監(jiān)測(cè)儀(芬蘭)；RBP-1B型大鼠血壓計(jì)(北京)；PHILIP M3562A血?dú)夥治鰞x(德國(guó))；LKB-V超薄切片機(jī)(瑞典)；Olympus顯微鏡(日本)；深低溫冰箱(美國(guó)Foina)

4、；HEIDOLPH DLAX900勻漿機(jī)(德國(guó))；UPSOH超聲波粉碎機(jī)(德國(guó))；S-500P紫外光可見(jiàn)光連續(xù)分光光度計(jì)(法國(guó))；ELX-800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tech Instrument)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó))；孵育箱(上海)；PTR-IOOPCR擴(kuò)增儀(美國(guó))；通用BIO-RAD PowerPac 200電泳儀(美國(guó))；水平板電泳儀(上海)；KODAK ID型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó))；目立HITACHI H-600透射電鏡(

5、日本)；島津SCL-10AVP高效液相色譜儀(日本)；半于轉(zhuǎn)印儀(美國(guó))；水平搖床(上海)。 二、實(shí)驗(yàn)方法： 1、動(dòng)物模型： 大鼠異氟烷吸入麻醉，參照Pringle方法，通過(guò)夾閉肝門(mén)后開(kāi)放建立大鼠肝門(mén)阻斷再灌注模型。 2、實(shí)驗(yàn)分組： Sham組：假手術(shù)組，開(kāi)腹分離肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈和膽管后關(guān)腹。 HPO組：全肝缺血30min后再灌注6h、12h、24h。 LIP組：在前兩部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)

6、上建立LIP預(yù)處理，先行下肢缺血10min后再灌注30min，繼以HPO 30min后再灌注6h。 3、觀察指標(biāo)和方法： ①?lài)毖贖R、MAP變化； ②再灌注后腦組織病理檢查(光鏡)；超微結(jié)構(gòu)的檢查(電鏡)； ③門(mén)脈開(kāi)放前后門(mén)靜脈血pH、[K<'+>]、[Ca<'2+>](血?dú)夥治?； ④回腸組織MPO活性測(cè)定(化學(xué)比色法)； ⑤腦組織和血清中S100β蛋白含量的改變(ELlsA法)；

7、 ⑥腦組織中Glu、Asp含量變化(HPLC法)； ⑦腦組織NMDAR1mRNA和NMDAR2BmRNA表達(dá)的變化(RT-PCR法)； ⑧腦皮層組織NMDA2R2β的蛋白表達(dá)(WesternBlot法)。 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果： 一、肝門(mén)阻斷再灌注后中樞和外周S100B蛋白的差異性改變。 1、基本參數(shù)：①血壓變化：Sham組實(shí)驗(yàn)期間血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，HPO組肝門(mén)阻斷期降低；再灌注后有-過(guò)性血壓下降，心

8、率增快。各組均保持在60mmHg以上。②HPO期間門(mén)靜脈pH顯著降低，[K<'+>]升幅超過(guò)1倍，但開(kāi)放后6h時(shí)已經(jīng)恢復(fù)；[Ca<'2+>]于再灌注后持續(xù)下降至12h。 2、光鏡下HPO組再灌注后腸道病理改變重于肝臟本身。肝細(xì)胞索、肝竇分界不清，氣球樣變性多見(jiàn)，灶性壞死；小腸粘膜表面糜爛，炎癥滲出，PMN細(xì)胞聚集，可見(jiàn)血管內(nèi)皮損傷。而Sham組肝細(xì)胞肝竇形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；小腸組織結(jié)構(gòu)正常。 3、腦皮層形態(tài)學(xué)：①光鏡：HPO組

9、再灌注6h后皮層神經(jīng)細(xì)胞較為稀疏，間質(zhì)水腫，見(jiàn)血管內(nèi)皮損傷，周?chē)M織有明顯空亮水腫。②電鏡下再灌注后6h超微結(jié)構(gòu)損害較為嚴(yán)重，腦組織水腫，以膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管周為重；膠質(zhì)細(xì)胞變性；血管周?chē)窠?jīng)突起水腫，崩解。 4、和Sham組比較，再灌注12h時(shí)HPO組皮層組織中S100β蛋白升高顯著(P<0.05)，6h和24h未見(jiàn)顯著差異(均P>0.05)5、血清S100p蛋白各組的的差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，但HPO再灌注后各

10、時(shí)點(diǎn)均有濃度超過(guò)0.2μg/L的個(gè)例數(shù)。組織和血清兩種S100β蛋白未見(jiàn)相關(guān)性。 二、肝門(mén)阻斷再灌注后腦組織興奮性氨基酸及NMDA受體mRNA表達(dá)的改變。 1、天門(mén)冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)Sham組變化均未見(jiàn)差異。與其同時(shí)點(diǎn)比較，HPO組再灌注后6h明顯升高(P<0.05)，12h和124h差異不顯著(均P>0.05)。同時(shí)見(jiàn)HPO組12h時(shí)較6h下降(P<0.05)，24hN沒(méi)有差異(P>0.05)，整體呈下

11、降趨勢(shì)。 2、NR1、NR2B的mRNA基因表達(dá)Sham組各時(shí)點(diǎn)變化未見(jiàn)差異。HPO組NRlmRNA在再灌注后6h，12h，24h較Sham同時(shí)點(diǎn)均顯著升高(均P<0.05)，HPO組間比較顯示12h升幅更大，24h下降接近6h水平。NR2BmRNA在再灌注后6h表達(dá)顯著升高(P<0.001)，而后逐漸下降。二者24h均恢復(fù)至對(duì)照組水平(均P>0.05)。 三、肢體缺血預(yù)適應(yīng)減輕肝門(mén)阻斷再灌注后腦皮層EAAs及NMDR表

12、達(dá)的增加。 1、模型生存率Sham組100％存活，HPO組生存率大幅降低僅為30.8％，LIP組能顯著提高存活率達(dá)到58.6％，組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2、形態(tài)學(xué)。 ①光鏡下HPO組小腸組織和肝臟均見(jiàn)損傷，LIP組的損傷較輕。②電鏡下，LIP組腦組織細(xì)胞改變趨勢(shì)輕于HPO組。 3、小腸MPO活性HPO組的MPO活性高于Sham組，LIP組低于HPO組(均P<0.05)，但仍高于Sham組

13、(P<0.05)。 4、EAAS 和Sham組比較，再灌注后HPO組的Glu、Asp和總量均明顯升高(均P<0.05)，LIP組接近Sham組水平(均P>0.05)。但LIP組Glu的升幅顯著低于HPO組(P<0.05)，EAAs總量也較低(P<0.05)。 5、NMDAR亞單位NR2B蛋白表達(dá)HPO再灌注后腦皮層細(xì)胞NR2B蛋白表達(dá)較Sham組明顯增加(P<0.05)，LIP組的蛋白表達(dá)升幅減少(P<0.05)

14、，但高于Sham組(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、肝門(mén)阻斷再灌注后并存肝和腸道損傷，且見(jiàn)腸道損傷更重。 2、肝門(mén)阻斷再灌注后可致大腦皮層損傷性改變，但腦損害有一定的發(fā)生率。 3、肝門(mén)阻斷再灌注后腦皮層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)激條件下S100β蛋白表達(dá)增加，但和血清S100 β蛋白變化趨勢(shì)未見(jiàn)明顯相關(guān)性。 4、肝門(mén)阻斷再灌注過(guò)程可啟動(dòng)神經(jīng)突觸間Glu和Asp的堆積，同時(shí)上調(diào)NMDARmRNA的表達(dá)。