葉酸-殼聚糖介導(dǎo)的Survivin shRNA基因納米復(fù)合物的研制.pdf

1、目的：制備葉酸-殼聚糖（Folate-coupled Chitosan）納米粒，并研究其作為survivin shRNA重組質(zhì)粒載體傳遞系統(tǒng)的可行性以及對肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率的檢測。為研究肝癌RNAi介導(dǎo)的基因治療打下基礎(chǔ)。 方法：在本研究中，通過葉酸活性脂與殼聚糖上的氨基反應(yīng)，使葉酸與殼聚糖偶聯(lián)。將異硫氰基熒光素與葉酸偶聯(lián)殼聚糖進(jìn)行化學(xué)嫁接，以離子交聯(lián)法制成具有熒光的葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒。并與肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞實驗。

2、然后將20μg/mL survivin shRNA重組質(zhì)粒和10μg/mL葉酸-殼聚糖混合制備基因納米復(fù)合物并檢測其理化性質(zhì)，同時以陽離子脂質(zhì)體基因復(fù)合物作為對照，將上述兩者轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，測定其轉(zhuǎn)染效率，Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞中survivin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：實驗結(jié)果顯示葉酸活性酯用量和反應(yīng)溫度及試劑滴加速度是影響偶聯(lián)比的主要因素。在葉酸活性酯與殼聚糖用量比為1：1，反應(yīng)溫度（30℃），滴加速度（

3、2mL/min），反應(yīng)時間為12 h的條件下可得到偶聯(lián)穩(wěn)定的葉酸偶聯(lián)殼聚糖。所制得的納米粒粒徑140nm，原子力顯微鏡下觀察其形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞熒光效果明顯。實驗成功制備葉酸-殼聚糖介導(dǎo)的Survivin shRNA基因納米復(fù)合物。該基因納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的效果強(qiáng)于陽離子脂質(zhì)體基因復(fù)合物。且轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá)顯著陽離子脂質(zhì)體基因復(fù)合物。 結(jié)論：采用離子交聯(lián)法，優(yōu)化工藝條件，成功制備粒徑較小、分布均勻的具有熒