基于殼聚糖季銨鹽-精氨酸聚合物載體的DNA納米復合物提高體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染功效.pdf

1、外源基因需借助載體的遞送方可發(fā)揮功效。殼聚糖生物相容、生物可降解、安全性好，可包載質(zhì)粒DNA(pDNA)形成納米復合物，介導體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染。但殼聚糖/pDNA納米復合物中性條件下穩(wěn)定性差，胞內(nèi)難以解離，轉(zhuǎn)染效率低，需對殼聚糖進行功能化修飾以提高轉(zhuǎn)染效率。DNA納米復合物在遞送過程中需克服影響轉(zhuǎn)染效率的一系列體內(nèi)外屏障，解析相關機制有助于合理設計遞送載體，實現(xiàn)外源基因的體內(nèi)外高效和穩(wěn)定表達。
　　殼聚糖經(jīng)季胺化修飾及精氨酸（Arg）

2、接枝，得到殼聚糖季銨鹽-精氨酸共聚物（TMC-Arg）。以TMC-Arg為陽離子聚合物載體，增強型綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒(pEGFP)為模式質(zhì)粒，制備納米復合物(TANC)，考察其體外轉(zhuǎn)染效率及接枝Arg后轉(zhuǎn)染效率提高的可能機理;通過加入不同比例的陰離子交聯(lián)劑三聚磷酸鈉(TPP)和γ-聚谷氨酸(γ-PGA)至TANC，研究交聯(lián)劑的組成對納米復合物體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率的影響。
　　制備四種不同TPP與γ-PGA比例的TANC，分別命名為TA

3、NC1、TANC2、TANC3和TANC4。TMC/pEGFP納米復合物(TNC)與TANC的粒徑均為100-150nm，電勢均為20-30 mV，TANC的電勢隨交聯(lián)劑組成中TPP含量的上升而下降。TNC和TANC均能有效縮合pEGFP，保護pEGFP免遭核酶降解。TANC在高離子強度及稀釋倍數(shù)條件下可保持納米復合物原有的結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性優(yōu)于TNC?？疾旒{米復合物在HEK293細胞的黏附和攝取，表明TNC和TANC均能有效黏附至細胞表面;

4、接枝Arg可促進納米復合物的細胞攝取，不含交聯(lián)劑的TANC1的細胞攝取量是TNC的2.1倍;交聯(lián)劑組成不同的TANC的細胞攝取水平隨TPP含量的上升而下降。加入內(nèi)吞抑制劑考察納米復合物的入胞途徑，結(jié)果表明TNC主要經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑入胞;不含交聯(lián)劑的TANC1和只含TPP的TANC4經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑入胞;含γ-PGA的TANC2和TANC3可經(jīng)小窩蛋白介導的內(nèi)吞途徑入胞?？疾旖宦?lián)劑的組成對TANC中pEGFP體外釋放的影響

5、，可見pEGFP的釋放速率和累積釋放量隨TPP含量的上升而增加，表明TMC-Arg與pEGFP的結(jié)合力隨TPP含量的上升而減弱。核質(zhì)分布試驗結(jié)果表明TNC和TANC均可有效遞送pEGFP至細胞核;接枝Arg可顯著提高pEGFP在細胞核的分布，12 h時TANC1中pEGFP在細胞核的分布是TNC的1.3倍;交聯(lián)劑的組成可影響TANC中pEGFP于不同時間在細胞核的分布，細胞核中分布達到峰值的時間隨TANC釋放速率的增加而縮短?？疾霻NC

6、和TANC在HEK293細胞體外轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h的效率，Arg修飾可顯著提高納米復合物的體外轉(zhuǎn)染效率，96 h時TANC1的轉(zhuǎn)染效率是TNC的1.3倍;交聯(lián)劑的組成可影響TANC的體外轉(zhuǎn)染效率，TANC3在48 h的轉(zhuǎn)染效率為35.1％，顯著高于TANC1、TANC2和TANC4;在96 h的轉(zhuǎn)染時程內(nèi)，TANC1的轉(zhuǎn)染效率隨時間延長而增加，而TANC2、TANC3和TANC4的轉(zhuǎn)染效率分別于72 h、48 h和24 h達