超聲及微泡聯(lián)合葉酸偶聯(lián)殼聚糖介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、目的：
　　1、合成和鑒定葉酸偶聯(lián)殼聚糖（FA-CS），制備 FA-CS納米粒并優(yōu)化反應(yīng)條件，觀察293T細(xì)胞對(duì)納米粒的吸收情況。
　　2、以FA-CS納米粒為非病毒基因載體，研究其與超聲（US）或US和聲諾維微泡（MB）聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的效率，并比較不同轉(zhuǎn)染方式對(duì)293T細(xì)胞活性的影響。
　　方法：
　　1、采用還原酰胺化法合成FA-CS，通過(guò)傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）鑒定合成的產(chǎn)物。2、采用復(fù)凝

2、聚法制備 FA-CS納米粒，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件，采用馬爾文粒度儀和透射電子顯微鏡（TEM）分析納米粒的粒徑分布、表面電荷和形態(tài)；倒置熒光顯微鏡觀察293T細(xì)胞對(duì)納米粒的吸收情況。
　　3、以表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒（pEGFP-C3）為報(bào)告基因，采用復(fù)凝聚法制備葉酸偶聯(lián)殼聚糖載基因（FA-CS/P）納米粒，通過(guò)馬爾文粒度儀和TEM觀察評(píng)估納米粒的粒徑分布、表面電荷和形態(tài)，瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)分析FA-CS與質(zhì)粒的結(jié)合情況，紫外微

3、量分光光度計(jì)檢測(cè)包載率。
　　4、體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為8組：空白對(duì)照組（C）、單獨(dú)質(zhì)粒組（P）、殼聚糖載基因納米粒組（CS/P）、FA-CS/P納米粒組（FA-CS/P）、超聲+聲諾維微泡+質(zhì)粒組（US+MB/P）、超聲+FA-CS/P納米粒組（US+FA-CS/P）、超聲+聲諾維微泡+FA-CS/P納米粒組（US+MB+FA-CS/P）、脂質(zhì)2000轉(zhuǎn)染組（L），通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率；應(yīng)用CCK-8法測(cè)定

4、不同處理方式對(duì)293T細(xì)胞活力的影響。
　　結(jié)果：
　　1、FTIR顯示葉酸和殼聚糖的反應(yīng)產(chǎn)物形成酰胺鍵，表明葉酸成功與殼聚糖偶聯(lián)；
　　2、經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，在FA-CS濃度為0.1 mg/ml、硫酸鈉濃度為50 nmol/L、反應(yīng)溫度為55℃時(shí)可制備形態(tài)較為規(guī)則的納米粒，其粒徑為250.6 nm、Zeta電位為40.5 mV，PDI為0.268；
　　3、倒置熒光顯微鏡觀察到293T細(xì)胞可有效吸收FA-CS納米

5、粒。
　　4、在FA-CS與質(zhì)粒的質(zhì)量比為3時(shí)，通過(guò)復(fù)凝聚法可制備粒徑為355.1 nm、Zeta電位為10.4 mV的FA-CS納米粒，其包載率為（90.8±1.8）％，TEM觀察納米粒的形態(tài)欠規(guī)則，但未見(jiàn)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象，瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)觀察到FA-CS可將基因滯留在加樣孔中；
　　5、通過(guò)熒光顯微鏡觀察到CS/P組，F(xiàn)A-CS/P組、US+MB/P組、US+FA-CS/P組和L組有明顯綠色熒光，而US+MB+FA-CS/

6、P組只有散在熒光，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：應(yīng)用US后，F(xiàn)A-CS/P組的基因轉(zhuǎn)染率升高到（17.13±0.30）%，但低于L組（41±2.51）%和US+MB/P組（21.13±5.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而聯(lián)合應(yīng)用US和MB后，F(xiàn)A-CS/P組的轉(zhuǎn)染率下降至（2.0±0.2）%，明顯低于CS/P組，F(xiàn)A-CS/P組、US+MB/P組、US+FA-CS/P組和L組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與C組、P組相比無(wú)統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　6、CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示CS/P納米粒和FA-CS/P納米粒對(duì)293T細(xì)胞的活力無(wú)明顯影響，分別為（90.3±2.5）%、（87.2±1.0）%，與單獨(dú)質(zhì)粒處理組[（94.7±2.7）%]相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），明顯高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組[（75.9±2.8）%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合US輻照后，F(xiàn)A-CS/P轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力下降至（80.4±1.9）%，與FA-CS/P納米粒

8、和L轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯差異（P＞0.05），但高于US+MB/P組[（70.6±1.6）%]和US+MB+FA-CS/P組[（64.1±4.6）%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；US+MB+FA-CS/P轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力最低，為（64.1±4.6）%，與其他各組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　本研究成功合成 FA-CS，并采用復(fù)凝聚法，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件制備了粒徑小、分散均勻的FA-CS納米粒，其可