鋸緣青蟹性別分化和性腺發(fā)育的EST及基因芯片初步分析.pdf

1、本研究采用SMART技術(shù)結(jié)合DSN處理，成功地構(gòu)建了線性化cDNA文庫三個，其中精巢和卵巢文庫各一個，另一個為精巢、卵巢、眼柄、輸精管、射精管和產(chǎn)雄腺混合的文庫。經(jīng)測定三個文庫的滴度分別為4.8×105 cfu/mL，3.1×106 cfu/mL，5.3×106 cfu/mL，所有三個文庫擴增后都含有1011以上重組子。各文庫的插入cDNA長度均分布在0.5-3kb，經(jīng)隨機PCR檢測，初步確定了三個文庫重組率分別為93.7％、95.8％

2、和100％。
　　 隨機從文庫中挑取6816個克隆(其中688個來自精巢文庫，926個來自卵巢文庫，5202個來自混合文庫)進行EST(Expressed Sequence Taq)測序，共得到6116條ESTs，其中測長大于100bp的有5160條，測長短于100bp的有813條，其余為空載。經(jīng)統(tǒng)計分析，5160條ESTs共代表了4136個基因，其中含有575個疊連群(Contigs)和3561條單基因(Singlets)，平

3、均冗余率為19.84％，平均讀長為348bp。經(jīng)生物信息學(xué)分析，998個為已知基因占總ESTs的24.13[％]，已知基因聚類后被初步歸為22類，其中有在生物學(xué)上與sry、sox、卵黃蛋白原、卵黃蛋白原受體、細胞周期蛋白、泛素、熱休克蛋白家族、抗氧化酶系統(tǒng)等基因具有相關(guān)性的序列。在測序及生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合相關(guān)軟件(Redhat Linux 9.0、apache、PHP、MySQL、wwwBLAST)構(gòu)建了本地化的序列查詢數(shù)據(jù)庫

4、，實現(xiàn)了EST數(shù)據(jù)的本地比對查詢管理等功能。
　　 以進行EST測序的6816單克隆為模板，去除冗余的克隆后進行大規(guī)模擴增，純化后用自動機械手點印至氨基化玻璃片基上制成含5664(59×96)個斑點的cDNA芯片。分別取等量成熟的雌雄個體的性腺總RNA以隨機6堿基寡核苷酸作為引物進行逆轉(zhuǎn)錄，合成參入了aa-dUTP的單鏈cDNA，隨后分別標記上Cy3和Cy5染料制成熒光探針去雜交印制在芯片上的探針，經(jīng)激光共聚掃描儀采集電子圖譜后