恩諾沙星在鋸緣青蟹（Scylla serrata）體內(nèi)藥物代謝規(guī)律研究.pdf

1、本論文建立了鋸緣青蟹不同組織中恩諾沙星高效液相色譜檢測(cè)法，研究了給藥途徑(肌肉注射、口灌給藥)、劑量、鹽度和溫度下，恩諾沙星在鋸緣青蟹體內(nèi)代謝規(guī)律。 1、測(cè)定方法建立。本研究?jī)?yōu)化了組織樣品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星提取方法、色譜條件，建立了鋸緣青蟹血淋巴、肌肉、肝胰臟和性腺等組織中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量同時(shí)檢測(cè)的高效液相色譜法。高效液相色譜儀采用艾捷倫公司Agilent 1100系列，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、熒光檢測(cè)器及HP化

2、學(xué)工作站，色譜柱為ZORBAX SB-C18，4.6×150 mm。流動(dòng)相為乙腈：磷酸鹽緩沖液(含10 mmol/L NaH2PO4和5 mmol/L溴化四丁基銨，25％磷酸調(diào)pH至2.0)=14.5：85.5(V/V)。流速為1.0 ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量10μL，熒光檢測(cè)器，Ex，280nm，Em，418nm。恩諾沙星和環(huán)丙沙星線性范圍為0.05-10μg/ml。恩諾沙星在血淋巴、肌肉、肝胰臟、精巢和卵巢中回收率分別為96

3、.11％、94.25％、86.55％、96.16％和90.01％；相應(yīng)組織中的環(huán)丙沙星的回收率分別為97.21％、82.83％、82.04％、87.36％和91.52％。恩諾沙星和環(huán)丙沙星在血淋巴、肌肉、肝胰腺、精巢和卵巢內(nèi)日內(nèi)精密度RSD分別為3.63％和3.48％、3.00％和4.63％、2.38％和3.12％、3.39％和．5.86％、3.20％和3.57％。恩諾沙星和環(huán)丙沙星在血淋巴、肌肉、肝胰腺、精巢和卵巢內(nèi)的日間精密度RSD

4、分別為4.76％、和4.99％、3.15％和5.17％、2.89％和3.82％、3.56％和5.25％、3.46％和2.02％。 2、代謝產(chǎn)物質(zhì)譜分析。同時(shí)，采用電噴霧離子阱質(zhì)譜法在正離子檢測(cè)方式下，以注射泵直接進(jìn)樣的方式對(duì)鋸緣青蟹口灌恩諾沙星給藥后血淋巴中恩諾沙星和代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。通過(guò)對(duì)血漿中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜裂解行為進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離分析，獲得了各化合物的多級(jí)質(zhì)譜信息，通過(guò)比較各化合物結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜裂解途徑的異同點(diǎn)，

5、發(fā)現(xiàn)有三個(gè)代謝產(chǎn)物，其中峰面積最大的為環(huán)丙沙星，其次為羥基化恩諾沙星，另一代謝產(chǎn)物可能是加氧恩諾沙星。通過(guò)定量分析，血漿中恩諾沙星和代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的濃度分別為19.1 μg/ml和0.526 μg/ml。 3、給藥途徑對(duì)藥動(dòng)學(xué)影響。本文分析了鹽度為33的海水養(yǎng)殖下恩諾沙星藥液肌肉注射和口灌給藥(劑量10 mg/Kg)后在鋸緣青蟹體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。肌肉注射和口灌給藥下，藥物吸收快(Tmax分別為1 min和0.5 h)，藥物吸收

6、好(Cmax分別為31.86μg/ml和12.903 μg/ml)。鋸緣青蟹血淋巴恩諾沙星濃度-時(shí)間曲線關(guān)系均適合采用二室模型來(lái)描述，口灌組具有一級(jí)吸收相。口灌組分布半衰期(t1/2a=3.364 h)高于肌肉注射給藥組(t1/2a=0.312 h)，而消除半衰期(t1/2β=34.644 h)低于肌肉注射給藥組(t1/2β=64.665 h)，總體清除率(CL=0.052l/h/kg)高于肌肉注射給藥組(CL=0.024 l/h/kg

7、)。兩組實(shí)驗(yàn)的肌肉和肝胰臟藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用統(tǒng)計(jì)矩原理求得。肌肉注射組，肌肉和肝胰臟恩諾沙星平均駐留時(shí)間分別為92.387 h和102.723 h，總體清除率分別為0.033 L/h/kg和0.007 L/h/kg，消除半衰期(t1/2z)分別為67.254 h和51.554 h?？诠嘟o藥組，肌肉和肝胰臟恩諾沙星平均駐留時(shí)間分別為36.364 h和464.223 h，總體清除率分別為0.029L/h/kg和0.016 L/h/kg，消除半衰

8、期(t1/2z)分別為65.504 h和47.735 h。肌肉注射組，恩諾沙星能被鋸緣青蟹很好地吸收和分布；相反地，肌肉注射組的恩諾沙星從鋸緣青蟹體內(nèi)的消除即變得緩慢。兩組試驗(yàn)的血淋巴、肌肉和肝胰臟中代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的濃度變化比較復(fù)雜，均呈現(xiàn)多峰現(xiàn)象。代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在三個(gè)組織中達(dá)峰時(shí)間不一致。肌肉注射組分別為48 h、96 h和96 h，峰濃度分別為0.227 μg/ml、0.194μg/g和O．176μg/g；口灌給藥組分別為48

9、h、48 h和24 h，峰濃度分別為0.074 μg/ml、0.095 μg/g和0.178 μg/g。在鋸緣青蟹體內(nèi)，恩諾沙星轉(zhuǎn)化成環(huán)丙沙星的比率較低，各組織中Cmax-CIP/Cmax-ENR在0.57％-1.57％之間，AUCCIP/AUCENR在1.38％-8.7％之間。口灌給藥下，恩諾沙星在鋸緣青蟹組織中吸收好，但消除也慢；到25d時(shí)血淋巴、精巢和卵巢中檢測(cè)不到恩諾沙星，肌肉和肝胰臟中恩諾沙星濃度分別為0.018μg/g和O．

10、032μ/g。 4、鹽度的影響。在鹽度4和鹽度33下，對(duì)鋸緣青蟹進(jìn)行恩諾沙星單劑量口灌給藥，給藥劑量為30mg/kg。兩鹽度下，恩諾沙星在蟹體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線適合用一級(jí)吸收的二室模型描述，血藥濃度與時(shí)間關(guān)系曲線及肌肉藥濃度和時(shí)間關(guān)系曲線均表現(xiàn)為雙峰現(xiàn)象，鹽度4組血淋巴和肌肉的第一峰濃度低于第二峰濃度，血淋巴中出現(xiàn)的時(shí)間分別為給藥后0.5h和2h，峰濃度分別為19.70μg/ml和30.53μg/ml；肌肉中兩個(gè)峰出現(xiàn)時(shí)間分別

11、為給藥后0.5h和2h，藥物濃度分別為13.16 μg/g和18.62 μg/g。而鹽度33組血淋巴和肌肉的第一峰濃度高于第二峰濃度，血淋巴中出現(xiàn)的時(shí)間分別為給藥后0.5h和4h，峰濃度分別為27.23 μg/ml和24.79μg/ml；肌肉中出現(xiàn)的時(shí)間分別為給藥后0.5h和6h，藥物濃度分別為16.04gμ/g和13.20μg/g。鹽度4時(shí)，Tmax=1 h，Cmax=253.57 μg/g；鹽度33時(shí)，Tmax=0.5h，Cmax=

12、349.95μg/g；兩鹽度下青蟹肝胰臟中恩諾沙星濃度均遠(yuǎn)高于血淋巴和肌肉，肝胰臟擔(dān)當(dāng)著“藥庫(kù)”的作用。但肝胰臟中的藥物消除也很快，在達(dá)到峰濃度后幾小時(shí)內(nèi)即降為最高濃度的10％左右。鹽度33下青蟹組織中環(huán)丙沙星AUC和MRT均高于低鹽度相應(yīng)組織中相應(yīng)值；而高鹽度下青蟹組織中環(huán)丙沙星Vz和CLz均低于低鹽度下相應(yīng)組織中的相應(yīng)值。鹽度33下，肌肉、血淋巴和肝胰臟中代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星消除均明顯慢于鹽度4組。鹽度4和鹽度33下三種組織中的代謝產(chǎn)物

13、環(huán)丙沙星濃度遠(yuǎn)低于原料藥恩諾沙星，血淋巴的AUCCIP/AUCENR分別為4.0％和3.8％。作者認(rèn)為，與畜禽動(dòng)物相比，在水產(chǎn)動(dòng)物中起臨床療效主要是恩諾沙星，而不是環(huán)丙沙星。 5、劑量的影響。劑量明顯影響藥物的吸收、分布與消除。30 mg/kg劑量下，血淋巴中恩諾沙星峰濃度(Cmax=27.23 μg/ml)、分布半衰期(t1，2=14.3 h)、消除半衰期(h1/2β=123.3 h)和曲線下面積(AUC0.t=2672.1

14、mg/1.h)顯著大于低劑量實(shí)驗(yàn)組(分別為12.90μg/ml、3.364 h、34.644 h和171.613 mg/1.h)。兩劑量組下，肝胰臟中恩諾沙星濃度差別很大，10 mg/kg和30 mg/kg兩個(gè)劑量下的鋸緣青蟹肝胰臟恩諾沙星峰濃度分別為22.30±1.95μg/kg和349.95±35.89μg/kg，高劑量下的肝胰臟恩諾沙星峰濃度是低劑量下峰濃度的近18倍。在30 mg/kg劑量下，肝胰臟恩諾沙星峰濃度分別是血藥峰濃度

15、、肌肉中恩諾沙星峰濃度的12.85倍、21.83倍；而在10 mg/kg劑量下，其相應(yīng)的比值分別是1.73倍、3.69倍。結(jié)果表明，高劑量口灌給藥下，大量藥物積聚在肝胰臟中，表現(xiàn)出肝胰臟“首過(guò)效應(yīng)”。 6、溫度的影響。溫度對(duì)恩諾沙星在鋸緣青蟹體內(nèi)吸收、分布和消除規(guī)律的影響。比較研究在19℃和26℃兩個(gè)溫度下，恩諾沙星口灌給藥下在鋸緣青蟹血淋巴中藥代動(dòng)力學(xué)。在本研究中，采取從蟹步足關(guān)節(jié)腔處連續(xù)取血方法，對(duì)每只蟹連續(xù)取血11次，得到

16、每只蟹的個(gè)體水平上血藥濃度-時(shí)間變化關(guān)系曲線。即使在同一溫度下鋸緣青蟹血藥濃度也存在著個(gè)體間差異，但同一溫度下不同個(gè)體間血藥濃度的變化總體趨勢(shì)還是一致的。從平均血藥濃度-時(shí)間曲線來(lái)看，兩溫度組下的血藥濃度達(dá)峰時(shí)間差別較大，19℃和26℃分別為6 h和2 h，峰濃度分別為7.26 μg/ml和11.03μg/ml。兩溫度下，恩諾沙星在鋸緣青蟹體內(nèi)的平均血藥濃度-時(shí)間曲線比較適合采用具有一級(jí)吸收的二室模型來(lái)描述，19℃下吸收半衰期(t1/2

17、ka)和分布半衰期(t1/2a)分別為3.68 h和4.96 h，顯著大于26℃相應(yīng)值(分別為1.08 h和1.53 h)，但兩溫度下的消除半衰期(t 1/2β)分別為79.083 h和56.521h。結(jié)果顯示，26℃下恩諾沙星的吸收、分布和消除明顯快于19℃。 7、休藥期建議。10mg/kg劑量口灌給藥下，恩諾沙星在鋸緣青蟹組織中吸收好，但消除慢；至給藥后20d，肌肉、肝胰臟、精巢和卵巢中恩諾沙星濃度分別為0.032 μg/g

18、、0.038 μg/g、0.022μg/g和0.027μg/g，都低于0.05 μg/g。比照恩諾沙星的最高殘留限量規(guī)定，鋸緣青蟹口服恩諾沙星的休藥期應(yīng)在20 d以上。 8、用藥方案制定。Cmax/AUC比值在8-10之間通常認(rèn)為是氟喹諾酮類藥物臨床藥效的臨界點(diǎn)。本研究中，多組實(shí)驗(yàn)的血淋巴以及其它組織中的Cmax/AUC比值都在10以上，說(shuō)明了恩諾沙星對(duì)防治鋸緣青蟹細(xì)菌性疾病的有效性。根據(jù)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)結(jié)果，若恩諾沙星以10mg