乙型腦炎病毒納米PCR檢測方法的建立及減毒株SA14-14-2序列的分析.pdf

1、流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)又稱日本腦炎，簡稱乙腦，是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種急性人獸共患傳染病。JEV屬于黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，為單股正鏈RNA病毒。本研究根據(jù)已發(fā)表的JEV減毒株SA14-14-2全基因序列設(shè)計合成5對引物，擴(kuò)增出覆蓋JEV仝基因的5個片段，并成功克隆至pEASY-Blu

2、nt載體上，經(jīng)測序拼接獲得JEV全基因組序列。結(jié)果表明，JEV全基因組長10977 bp，除5'端95個核苷酸和3'端385個核苷酸為非編碼區(qū)以外，其余10296個核苷酸編碼一個丌放閱讀框(ORF)，依次編碼以下蛋白:C、PrM、E三個結(jié)構(gòu)蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5七個非結(jié)構(gòu)蛋白。將此全序列與已發(fā)表的SA14源毒株核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行比較分析，其同源性均為99％以上。并發(fā)現(xiàn)10701位有堿基G

3、的插入，多數(shù)其他已發(fā)表的序列均有此情況發(fā)生，這可能是傳代過程中為適應(yīng)環(huán)境而引起的自然突變。測定SA14-14-2株全基因序列，不僅為開展基因工程疫苗研究奠定基礎(chǔ)，為應(yīng)用于生產(chǎn)的減毒活疫苗的質(zhì)控提供了寶貴的材料，也為進(jìn)一步構(gòu)建感染性克隆奠定工作基礎(chǔ)。
　　納米PCR技術(shù)是一種新型的PCR技術(shù)，其原理是把粒徑為1 nm～100nm的固相納米金屬顆粒懸浮在液體中形成納米流體。JEV的E基因編碼JEV的囊膜糖蛋白(envelope gly

4、coprotein)，E蛋白是病毒顆粒表面最重要的成分，有多個抗原表位，在病毒入侵宿主中起到重要作用。本研究根據(jù)JEV E基因的保守區(qū)域設(shè)計一對擴(kuò)增270 bp片段的特異性檢測引物，將納米金顆粒添加到PCR反應(yīng)體系中，同時優(yōu)化反應(yīng)條件，首次建立了高效、靈敏的納米PCR檢測方法。采用該方法靈敏度可達(dá)1.96×102 copies，普通PCR方法僅為1.96×104 copies，且與其他病毒沒有交叉感染。由丁納米材料具有良好的熱傳導(dǎo)性，因

5、此在添加了納米金顆粒的PCR循環(huán)體系中，PCR反應(yīng)會更快地達(dá)到目標(biāo)溫度，減少了在非目標(biāo)溫度的停留時間，進(jìn)而縮短整個體系達(dá)到溫度平衡所用的時問，減少非特性擴(kuò)增，提高特異性擴(kuò)增產(chǎn)量。通過試驗(yàn)研究表明，該納米PCR檢測方法不僅特異性好，而且其敏感性是普通PCR檢測方法的100倍。果用納米PCR方法和普通PCR方法對臨床送檢的32份樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果納米PCR檢出2份陽性樣品，普通PCR檢測均為陽性。研究表明，該檢測方法不僅為JEV的檢測提